2.1 Anaerobe Atmung

Während der Atmung oxidieren verschiedene membranassoziierte Dehydrogenasen wasserlösliche Substrate und reduzieren Menachinon (MK) in der Membran zu Menachinol. Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen verwendet, um Sauerstoff zu Wasser zu reduzieren, während unter anaeroben Bedingungen Nitrat und Wachstumselektronen auf Nitrat übertragen werden, um Nitrit zu erhalten (Abb. 5.1). Ein Hauptelektronendonor der Atmung ist NADH + H +, das in der Glykolyse und im Tricarbonsäurezyklus produziert wird. Zwei Arten von membrangebundenen NADH-Dehydrogenasen, NDH-I und NDH-II, wurden für Bakterien beschrieben, um die Oxidation von NADH + H + zu NAD + zu katalysieren (Yagi, 1993). NDH-I besteht aus 14 Untereinheiten, die vom Nuo-Operon in Escherichia coli codiert werden, und enthält Flavinmononukleotid (FMN) und mehrere Eisen–Schwefel-Cluster, um den Elektronentransfer mit dem Protonenpumpen über die Membran zu koppeln. NDH-II besteht aus einer einzelnen Untereinheit, die vom ndh-Gen kodiert wird. NDH-II ist kein integrales Membranprotein, sondern mit der Innenseite der Zytoplasmamembran assoziiert. Es enthält Flavinadenindinukleotid (FAD) als prothetische Gruppe und der Elektronentransfer ist nicht an die Protonentranlokation gekoppelt. Im B. subtilis-Genom kodieren drei Gene, yjlD, yumB und yutJ, für potentielle NADH-Dehydrogenasen vom NDH-II-Typ, während ein nuo-Operon im B. subtilis-Genom fehlt (Kunst et al., 1997). YjlD, umbenannt in Ndh, besteht aus 392 Aminosäureresten und zeigt 29% Sequenzidentität zu NDH-II von E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Interessanterweise ist die Menge an Ndh-Protein von B. subtilis wurde unter anaeroben Bedingungen signifikant reduziert gefunden (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh scheint die wichtigste aerobe NADH-Dehydrogenase von B. subtilis zu sein, da die Mutation des ndh-Gens einen aeroben Wachstumsdefekt aufwies (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). In der Zwischenzeit wurde gezeigt, dass die Expression des yjlC-ndh-Operons durch den Rex-Regler, einen Redox-sensitiven Transkriptionsregler, reguliert wird, der auf das NADH / NAD + -Verhältnis anspricht (siehe auch Abschnitt 3.3) (Gyan et al., 2006). Im Gegensatz dazu wurde in Transkriptomstudien die Expression des yumB-Gens unter bestimmten respiratorischen Bedingungen induziert gefunden (E. Härtig, unveröffentlichte Ergebnisse). Ob YumB und YutJ eine NADH-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen, wie durch Proteinsequenzähnlichkeit vorgeschlagen, und ob sie unter bestimmten Wachstumsbedingungen der Atemwege relevant sind, muss bestimmt werden.

B. subtilis besitzt wie andere aerob atmende Organismen eine Succinatdehydrogenase (sdh) oder genauer eine Succinat:Chinonoxidoreduktase, SQR (Hägerhäll, 1997). Der Enzymkomplex ist ein integraler Bestandteil der Zytoplasmamembran in Bakterien und der inneren Mitochondrienmembran in Eukaryoten. Es katalysiert die Oxidation von Succinat zu Fumarat in Verbindung mit der Reduktion von Chinon. Dabei ist das Enzym ein funktioneller Bestandteil sowohl des Zitronensäurezyklus als auch der Atmungskette (Hägerhäll, Aasa, von Wachenfeldt, Hederstedt, 1992). SQR in B. subtilis reduziert MK und hat drei Proteinuntereinheiten, SdhA, SdhB und SdhC. SdhA ist ein Flavoprotein mit einem kovalent gebundenen FAD, das die Zwei-Elektronen-Oxidation von Succinat zu Fumarat im Zytoplasma durchführt. SdhB enthält drei Eisen-Schwefel-Cluster (, , und ), die beim Elektronentransfer zwischen der Flavingruppe und Häm b von Cytochrom b558 im SdhC fungieren. SdhC hat fünf transmembrane α-helikale Segmente und verankert das SdhAB-Dimer auf der cytoplasmatischen Seite der Membran und fungiert beim Transmembranelektronentransfer zu MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoi, Aasa, & Hederstedt, 2000). Die beiden Häm-b-Cofaktoren vermitteln den Transfer von Elektronen über die Zytoplasmamembran zur Außenseite der Membran, an der MK reduziert und zwei Protonen verbraucht werden (Hederstedt, 2002). Dies unterscheidet sich von E. coli, wo die Protonen für die Reduktion von Ubichinon zu Ubiquinol auf der negativen Seite der Membran verbraucht werden, was das Membranpotential nicht beeinflusst. B. subtilis und andere Bazillen, wie Bacillus megaterium und Bacillus cereus Stämme, können unter oxischen Bedingungen mit Succinat als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium und B. cereus wachsen nicht unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von Glycerin. In Übereinstimmung fehlen Gene für eine Glycerin-3-Dehydrogenase in den Genomen. In B. subtilis wurde jedoch ein glpD-Gen für die aerobe Variante des membranlokalisierten Elektronentransfersystems nachgewiesen. Es wurde keine Homologie zu Genen gefunden, die für andere in E. coli vorhandene primäre Dehydrogenasen kodieren, wie verschiedene Formiatdehydrogenase, Hydrogenasen, l-Lactatdehydrogenase, d-Aminosäuredehydrogenase, Malat: Chinonoxidoreduktasen oder die Quinoprotein-Glucosedehydrogenase. Offensichtlich besitzt B. subtilis nur einen begrenzten Satz primärer elektronenspendender Dehydrogenasen, nämlich verschiedene Formen von NDH-II und aerobe Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase.

Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen von Menaquinol über den Cytochrom-bc1-Komplex an die Cytochrom-c-Oxidase vom aa3-Typ weitergegeben. Unter mikroaerophilen Bedingungen wird die Cytochrom-bd-Typ-Menachinoloxidase mit hoher Sauerstoffaffinität verwendet. Fumarat als terminaler Elektronenakzeptor wurde für verschiedene Bazillen, einschließlich B. subtilis, ausgeschlossen (Schirawski & Unden, 1995). Folglich werden Gene für eine Fumaratreduktase nicht im B. subtilis-Genom gefunden. Andere Bazillenstämme wie Bacillus licheniformis und Bacillus circulans können Fumarat wie E. coli atmen.

Unter anaeroben Wachstumsbedingungen überträgt B. subtilis die Elektronen ausschließlich auf die respiratorische Nitratreduktase. In Bakterien werden drei verschiedene Nitratreduktase-Systeme klassifiziert: die cytoplasmatischen assimilatorischen NAD (P) H-abhängigen Nitratreduktasen (Nas), die membrangebundene respiratorische Nitratreduktase (Nar) und die periplasmatischen dissimilatorischen Nitratreduktasen (Nap). Alle drei gehören zur Familie der DMSO-Reduktase-Proteine und enthalten den Bis-Molybdopterin-Guanin-Dinukleotid (MGD) -Cofaktor (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). Das B. subtilis-Genom kodiert nur für die respiratorische Nitratreduktase Nar. Nar-Enzyme bestehen typischerweise aus drei Untereinheiten. Die große Untereinheit NarG enthält das aktive Zentrum mit dem MGD-Cofaktor, eine kleinere lösliche Untereinheit NarH beherbergt ein und drei Zentren, und die Untereinheit NarI ist ein Cytochrom b. Nar ist eine Chinoloxidase und der Menachinolpool wird durch die Cytochrom-b-Untereinheit NARI oxidiert. Zwei Elektronen fließen über das Häm b von NarI zu den Eisen-Schwefel-Clustern von NarH und schließlich zur zytoplasmatischen Untereinheit NarG, die Nitrat zu Nitrit reduziert. Das NarJ-Protein ist nicht Teil des Enzyms, wird aber für die Endmontage des membrangebundenen Enzyms benötigt (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). Aufgrund der unterschiedlichen Stellen für die Chinoloxidation im Periplasma und für die Nitratreduktion im Cytosol trägt die Nitratreduktase Nar zur Erzeugung eines Protonengradienten bei (Abb. 5.1). Der nar-Locus besteht aus dem narGHJI-Operon (kodierend für respiratorische Nitratreduktase), narK (für ein potentielles Nitrit-Extrusionsprotein), dem offenen Leserahmen ywiC (unbekannter Funktion), arfM, das für den Modulator der anaeroben Atmung und Fermentation kodiert, sowie dem Gen für den anaeroben Regulator Fnr (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

Nitrit wird dann durch die assimilatorische Nitritreduktase NasDE weiter in Ammoniak umgewandelt (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Assimilatorische oder ammoniumproduzierende NADH-abhängige Nitritreduktase ist ein sirohemhaltiges Enzym, das die Sechs-Elektronen-Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Die Nitritreduktase-Gene nasDE waren Teil eines nasDEF-Operons und fanden sich unmittelbar stromabwärts des nasBC-Operons, das für die NADH-abhängige Nitratreduktase kodiert (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).