Abstract

Myoepithelium ist in caninen Mammatumoren als ruhende und proliferative suprabasale und spindelförmige und sternförmige interstitielle Zellen vorhanden. Ziel dieser Arbeit war es, ein Panel von Markern zur Identifizierung von vier verschiedenen myoepithelialen zellmorphologischen Typen in der normalen und neoplastischen Brustdrüse zu evaluieren und immunhistochemische Veränderungen von einem epithelialen zu einem mesenchymalen Phänotyp zu untersuchen. Cytokeratin 19 (CK19), Cytokeratin 5/6 (CK5 / 6), Cytokeratin 14 (CK14), Östrogenrezeptor (ER), p63-Protein, Vimentin (VIM) und α-glattes Muskelaktin (Alpha-SMA) Antikörper wurden an 29 Neoplasmen (3 benigne und 3 maligne myoepitheliale Tumoren, 7 Karzinome in gutartig gemischten Tumoren und 16 komplexe Karzinome) und an normalem Gewebe von Brustdrüsen. Alle diese Antikörper wurden auch an 3 Brustgeweben von Tieren ohne Brustpathologie getestet. Die myoepithelialen Marker wurden in den suprabasalen Zellen gut exprimiert und gingen in den beweglichen Typen allmählich verloren, wobei die Sternzellen nur die für Mesenchym typische VIM-Expression beibehielten. ER markierte einige ruhende und bewegliche Myoepithelzellen. Auf der Grundlage unserer Ergebnisse schlagen wir einen Übergang von myoepithelialen Immotilzellen zu wandernden fibroblastenähnlichen Zellen vor. Dieser Übergang und die Charakterisierung eines immunhistochemischen Panels für ruhende und bewegliche Myoepithelzellen werfen mehr Licht auf das biologische Verhalten von Myoepithelzellen.

1. Einführung

Brustdrüsentumoren von Hunden werden sowohl von epithelialen (Epithel und Myoepithelium) als auch von mesenchymalen Komponenten gebildet. Der Ursprung der Mesenchymzellen wird noch diskutiert. Die erhöhte Häufigkeit von Tumoren mit myoepithelialer oder basaler Zellproliferation ist ein einzigartiges Merkmal von Brusttumoren bei Hunden .

In der normalen Brustdrüse wird die Lumina durch eine innere Schicht polarisierter Epithelzellen begrenzt, die auf zwei äußeren oder basalen Schichten von Epithel- und Myoepithelzellen ruhen . Sowohl basale als auch Myoepithelzellen synthetisieren die Basalmembran von Kanälen und Alveolen und bilden eine strukturelle Barriere zwischen den luminalen Epithelzellen und dem umgebenden Stroma . In Kanälen bilden Myoepithelzellen eine nahezu kontinuierliche Schicht von Zellen, die parallel zur Längsachse der Kanäle ausgerichtet sind. Diese Schicht umgibt die luminalen Epithelzellen und trennt sie von der Basalmembran und dem Stroma. In Alveolen sind die Myoepithelzellen diskontinuierlich und bilden ein korbartiges Netzwerk um die Alveolen, so dass einige luminale Epithelzellen die Basalmembran direkt kontaktieren können . Daher befindet sich das Myoepithelium nicht nur in einer idealen Position, um zwischen diesen beiden Kompartimenten zu kommunizieren, sondern es ist auch in der Lage, wichtige regulatorische Signale für die Aufrechterhaltung einer normalen Zellstruktur bereitzustellen .

Basierend auf der Immunhistochemie zeigen die drei Zellschichten der normalen Brustdrüse unterschiedliche Marker: das luminale Epithel ist mit CK19 markiert, und die Basalzellen und Myoepithelzellen werden mit CK5 / 6 und CK14 und p63, Alpha-SMA und VIM gefärbt . Myoepithelzellen sind kontraktile Elemente, die ein kombiniertes epitheliales und glattes Muskelimmunprofil aufweisen. Die oben genannten Marker werden im Zytoplasma exprimiert, mit Ausnahme von p63, einem Kernmarker . Die myoepitheliale Zellschicht ist die einzige Quelle des Tumorsuppressors p63, der bei der Proliferation und Invasion assoziierter Tumorzellen signifikant gehemmt wird . Darüber hinaus werden basale Myoepithelzellen in der normalen Brustdrüse gelegentlich durch einen Antikörper markiert , der für die molekularbasierte Klassifizierung von Brusttumoren bei Hunden verwendet wird .Verschiedene Myoepithelzellmorphologien können in komplexen und gemischten Tumoren des Hundes erkannt werden: ruhende und proliferative suprabasale Myoepithelzellen sowie spindelförmige und sternförmige bewegliche interstitielle Myoepithelzellen. Suprabasale Zellen befinden sich zwischen der Basalmembran und dem luminalen Epithel und weisen abgeflachte Spindel (ruhende Zellen) oder polygonale Morphologien (proliferative Zellen) auf. Interstitielle Zellen sind häufig in festen Nestern angeordnet, die epithelialen Elementen zugeordnet oder im Interstitium isoliert sind . Spindel- und sternförmige Myoepithelzellen differenzieren sich zu einem allgemeineren kontraktilen Phänotyp .

Interstitielle Myoepithelzellen können schließlich fibroblastenähnliche Zellen werden, die nur VIM-Immunreaktivität zeigen . Die myoepitheliale Differenzierung kann zur Bildung verschiedener mesenchymaler Gewebe führen, einschließlich Knorpel und Knochen im gemischten Tumor der Eckzahnbrust.

Der Erwerb typischer Merkmale mesenchymaler Zellen dürfte durch einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) entstehen. EMT ist ein biologisches Phänomen, das es einer polarisierten Epithelzelle, die normalerweise über ihre basale Oberfläche mit der Basalmembran interagiert, ermöglicht, mehrere biochemische Veränderungen zu erfahren, die es ihr ermöglichen, die Merkmale und Funktionen von Mesenchymzellen anzunehmen .

Dieser Beitrag konzentriert sich auf verschiedene Aspekte von Myoepithelzellen und Brusttumoren bei Hunden, insbesondere (1) die Charakterisierung der vier verschiedenen morphologischen Typen von Myoepithelzellen in der normalen und neoplastischen Brustdrüse unter Verwendung eines Panels von Antikörpern und (2) die immunhistochemischen Veränderungen in Myoepithelzellen von einem epithelialen zu einem mesenchymalen Phänotyp.

2. Materialien und Methoden

2.1. Proben

Brustdrüsenproben von 29 weiblichen Hunden wurden aus der Datenbank des Anatomopathologischen Dienstes der Veterinärmedizinischen Fakultät von Bologna entnommen. Die Probanden gehörten verschiedenen Rassen: mongrel (𝑛=13), der Deutsche Schäferhund (𝑛=3), Pudel (𝑛=3), Yorkshire Terrier (𝑛=3), Dackel (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Pointer (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), Siberian Husky (𝑛=1); Sie waren alle Weibchen, mit einem durchschnittlichen Alter von 9,20±2.28 Jahren (Mittelwert ± SD). Die Tumoren bestanden aus: 3 gutartigen myoepithelialen Tumoren, 3 malignen myoepithelialen Tumoren, 7 Karzinomen in gutartigen gemischten Tumoren und 16 komplexen Karzinomen (die letzten beiden Gruppen wurden durch das Vorhandensein von Knorpel und / oder Knochen in den gemischten Tumoren unterschieden). Zusätzlich wurden 29 Proben aus normalen Brustdrüsen der gleichen Tumorlinie und 3 Brustproben von 3 gesunden nicht-mammären tumortragenden Hündinnen ausgewertet.

Tumore wurden nach Misdorp et al. und Goldschmidt et al. in gutartige myoepitheliale Tumoren: ein seltenes Neoplasma, das aus Myoepithelzellen besteht, die in kurzen Bündeln angeordnet sind und mit einem extrazellulären fibrillären basophilen Material versetzt sind; bösartige myoepitheliale Tumoren: anders als die gutartige Variante mit polymorpheren Myoepithelzellen; komplexes Karzinom: ein Karzinom, das sowohl aus luminalen epithelialen als auch aus myoepithelialen Bestandteilen besteht; Karzinom bei gutartigen Tumoren: ein Tumor mit Herden bösartig erscheinender Epithelzellen oder ausgeprägter Knötchen solcher Zellen, die zusammen mit Mesenchymzellen auftreten, die Knorpel und / oder Knochen produziert haben, möglicherweise in Kombination mit fibrösem Gewebe.

2.2. Immunhistochemie

Vier µm dicke Schnitte wurden aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Blöcken geschnitten, die repräsentative Tumorproben enthielten. Immunhistochemie für die folgenden Marker wurde an diesen Geweben durchgeführt: CK19, SICH, CK5/6, CK14, VIM, Alpha-SMA, p63.

Schnitte wurden in Toluol entwachsen und rehydriert. Endogene Peroxidase wurde durch Eintauchen in 0,3% Wasserstoffperoxid für 20 min blockiert. Anschließend wurden Schnitte in Tris-Puffer gespült. Die Antigenentnahme wurde mit Citratpuffer (2,1 g Zitronensäuremonohydrat / Liter destilliertes Wasser), pH 6,0 (außer CK5 / 6 und ER, die EDTA verwendeten, pH 8,0) und Erhitzen für zwei 5-Minuten-Perioden in einem Mikrowellenofen bei 750 W durchgeführt, gefolgt von Abkühlen bei Raumtemperatur für 20 min. Die Primärantikörper sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Alle Primärantikörper wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer kommerziellen Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Technik (LSAB-Kit, Dako, Amsterdam, Niederlande). Als Chromogen wurde Diaminobenzidin (0,05% für 10 min bei Raumtemperatur) verwendet. Objektträger wurden mit Papanicolaous Hämatoxylin gegengefärbt.

Als Negativkontrolle wurde der Primärantikörper durch einen irrelevanten, isotypangepassten Antikörper zur Kontrolle der unspezifischen Bindung des Sekundärantikörpers ersetzt. Positive Gewebekontrollen unter Verwendung derselben IHC-Protokolle umfassten die normale Brustdrüse des Hundes (Anti-CK19-, -ER-, -CK14-, -VIM-, Alpha-SMA-, -p63-Antikörper) und die Haut des Hundes (Anti-CK5 / 6).

Die Anzahl der positiven Zellen pro Marker wurde semiquantitativ berechnet: − = keine gefärbten Zellen, ± = weniger als 5% positive Zellen, + = 5-50% positive Zellen, ++ = mehr als 50% positive Zellen. Fälle wurden als positiv für ER angesehen, wenn in mindestens 5% der Tumorzellen eine Kernfärbung beobachtet wurde .

3. Ergebnisse

Vier Arten von Myoepithelzellen wurden anhand ihrer Morphologie erkannt. Der ruhende Subtyp zeigte die länglichen Merkmale von Spindelzellen in engem Kontakt mit luminalen Epithelzellen sowie proliferierenden suprabasalen Zellen, die stattdessen eine polygonale Form aufwiesen (Abbildung 1(a)). Es wurde beobachtet, dass die interstitiellen beweglichen Zellen sowohl Nester bildeten (die vom Spindeltyp ausgekleideten Nester und die Sternzellen bildeten den Nestkern) als auch im Interstitium isoliert wurden (Abbildung 2 (a)).

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Abbildung 1

Suprabasale Myoepithelzellen: ruhende (dünne Pfeile) und proliferative (dicke Pfeile) Zellen. Immunhistochemische Expression einer Gruppe von Antikörpern, die von IHC angewendet wurden, 63x (a) Hämatoxylin-Eosin; (b) Anti-CK19-Antikörper, die das Zytoplasma markieren; (c) Anti-ER-Antikörper, die die Kerne markieren; (d) Anti-CK 5/6-Antikörper, die das Zytoplasma markieren; (e) Anti-CK14-Antikörper, die das Zytoplasma markieren; (f) Anti-VIM-Antikörper, die das Zytoplasma markieren; (g) Anti-Alpha-SMA-Antikörper, die die Zytoplasmamembran markieren; (h) Anti-p63-Antikörper, die die Kerne markieren.

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Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) Anti-VIM-Antikörper, die das Zytoplasma markieren; (g) Anti-Alpha-SMA-Antikörper, die die Zytoplasmamembran markieren; (h) Anti-p63-Antikörper, die die Kerne markieren.

3.1. Normale Brustdrüse

In den 3 Kontrollfällen wurden alle ruhenden und proliferativen suprabasalen Myoepithelzellen mit p63, CK14, Alpha-SMA und VIM markiert. Ruhende und proliferative suprabasale Myoepithelzellen exprimierten in keinem der Fälle CK19.

3.2. Brustgewebe aus derselben Linie des Brusttumors

In den 29 normalen Geweben in derselben Linie wie die Tumoren wurden alle ruhenden und proliferativen suprabasalen Myoepithelzellen mit p63, CK14, Alpha-SMA und VIM markiert. CK5 / 6 war in allen bis auf vier Fällen positiv und ER wurde in 12 Fällen nachgewiesen. Die CK19-Expression wurde nur im luminalen Epithel beobachtet. Myoepitheliale bewegliche interstitielle Zellen wurden nicht beobachtet. Alle Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

3.3. Mammatumoren

Immunhistochemische Ergebnisse für suprabasale (Abbildung 1) und bewegliche Zellen (Abbildung 2) unter Verwendung von p63, CK14, CK5 / 6, CK19, Alpha-SMA, VIM und ER sind in Tabelle 2 zusammengefasst. CK5/6 markiert: suprabasale Ruhezellen in 16 der 29 Fälle (5 Karzinome bei gutartigen Mischtumoren und 11 komplexe Karzinome). CK 5/6 markierte in 10 Fällen auch proliferative suprabasale und spindelbewegliche Zellen (3 Karzinome bei gutartigen Mischtumoren und 7 komplexe Karzinome). Sternförmige bewegliche Zellen waren in 25 Fällen vorhanden (1 benigner myoepithelialer Tumor, 3 maligner myoepithelialer Tumor, 5 Karzinome bei gutartigen Mischtumoren und 15 komplexe Karzinome), waren jedoch negativ für CK5 / 6. Knorpel in gemischten Brusttumoren war immer negativ.CK14 zeigte eine Positivität in 23 Fällen in ruhenden Zellen (mit Ausnahme von 1 komplexem Karzinom und gutartigen und bösartigen myoepithelialen Tumoren), in 22 Fällen in proliferativen Zellen (6 Karzinome in gutartigen gemischten Tumoren und 15 komplexe Karzinome) mit einem Trend, die Expression zu verlieren, wenn diese Zellen den beweglicheren Phänotyp von Spindelzellen erworben hatten (positiv in 2 gutartigen und 3 bösartigen myoepithelialen Tumoren, 2 Karzinome in gutartigen gemischten Tumoren und 2 komplexe Karzinome). Chondrozyten von gemischten Tumoren waren negativ.

VIM war in suprabasalen Zellen in den 23 Fällen von Karzinomen bei gutartigen Tumoren und komplexen Karzinomen und in beweglichen Myoepithelzellen in allen 29 Fällen positiv. Stromazellen waren in allen Fällen positiv. Knorpel war bei allen 7 Karzinomen in gutartig gemischten Tumoren VIM-positiv.

Alpha-SMA markierte ruhende und proliferative suprabasale Myoepithelzellen in 23 Karzinomen in gutartig gemischten Tumoren und komplexen Karzinomen. Die Spindelzellen zeigten in 10 Fällen (5 Karzinome im benignen Mischtumor und 5 komplexe Karzinome) eine Positivität für Alpha-SMA. In jedem Fall, mit Ausnahme von zwei komplexen Karzinomen, waren Sternzellen negativ. Stroma zeigte Positivität in nur 6 Fällen (1 Karzinom in gutartigen gemischten Tumor und 5 komplexe Karzinome).

P63 wurde in ruhenden und proliferativen suprabasalen Myoepithelzellen der 23 Fälle von Karzinomen bei gutartig gemischten Tumoren und komplexen Karzinomen nachgewiesen. Alle Spindel- und sternförmigen beweglichen Zellen waren negativ. Stromazellen und Knorpel waren negativ.

ER-Expression war in 11 suprabasalen Myoepithelzellen vorhanden (4 Karzinome in gutartig gemischten Tumoren und 7 komplexe Karzinome); spindel- und sternförmige bewegliche Zellen waren in 9 Fällen positiv (3 Karzinome bei gutartig gemischten Tumoren und 6 komplexe Karzinome). Der Nachweis von gemischten Tumoren war negativ.

Ruhende und proliferative suprabasale und spindel- / sternbewegliche Myoepithelzellen exprimierten CK19 in keinem der untersuchten Tumoren. Der Nachweis von gemischten Tumoren war ebenfalls negativ für CK19.

4. Diskussion

Basierend auf den Ergebnissen von Gama et al. und Tateyama et al. , vier morphologische Arten von Myoepithelzellen sind in der Brustdrüse vorhanden: ruhende und proliferative suprabasale Myoepithelzellen, die Alveolen und Gänge auskleiden, sowie spindelförmige und sternförmige interstitielle bewegliche Zellen, die im interstitiellen Raum liegen, wo sie in Nestern angeordnet sein können. Myoepitheliale Marker wie p63, CK5 / 6, CK14, Alpha-SMA und VIM erwiesen sich als wertvolle diagnostische Hilfsmittel, um die Bewertung komplexer und gemischter Proliferationen zu erleichtern. CK19 gilt als Goldstandardmarker für luminales Epithel und wurde verwendet, um Fehldiagnosen mit Myoepithelzellen zu vermeiden. Aufgrund von Kreuzreaktivitätsmustern und der Tatsache, dass Läsionsherde typischerweise winzig sind, hatte keiner der myoepithelialen Marker eine 100% ige Sensitivität und Spezifität für Myoepithelzellen. Daher sollten mindestens 2 Marker verwendet werden, um einen bestimmten Fokus zu bewerten .Basierend auf unseren Ergebnissen war der beste Marker für suprabasale Zellen p63, insbesondere in Verbindung mit CK14, das auf reife (basale) Myoepithelzellen beschränkt war, und in geringerem Maße gefolgt von CK5 / 6, Alpha-SMA und VIM (Abbildung 1). CK5 / 6 markierte jedoch auch luminale Epithelzellen, was es schwierig machte, sie von proliferativen suprabasalen Myoepithelzellen zu unterscheiden . Morphologisch können sowohl Epithel- als auch Myoepithelzellen eine polygonale Form haben. Ein Merkmal von CK14 und CK5 / 6, aber nicht von p63, Alpha-SMA und VIM, war ihre reduzierte Expression in Myoepithelzellen im suprabasalen Proliferationszustand. Die Expression von CK14, CK5 / 6 und p63 ging in Zellen im spindelbeweglichen und sternbeweglichen Zustand allmählich verloren.

Alpha-SMA und VIM waren in spindelbeweglichen Myoepithelzellen mit unterschiedlichen Intensitätsgraden vorhanden. Nur VIM erwies sich als konsistenter Marker für sternförmig bewegliche Myoepithelzellen. In dieser Studie wurde das sternförmig bewegliche Myoepithelium in Nestern angeordnet und von ruhenden Zellen ausgekleidet, die vermutlich alveolären Ursprungs waren. Dieses Merkmal kann die Idee unterstützen, dass die Nester von sternförmig beweglichen Myoepithelzellen, die die Expression der wichtigsten myoepithelialen suprabasalen Marker verloren haben, aber die Affinität zu VIM beibehalten haben, die Vorläufer von Knorpel sind, was darauf hinweist, dass diese Zellen ihre Umwandlung in mesenchymale Elemente abgeschlossen haben. Bei benignen und malignen myoepithelialen Tumoren zeigten die VIM-Markierung in allen Fällen, der Verlust aller anderen suprabasalen myoepithelialen Marker und die geringe Positivität gegenüber CK14 in Spindelzellen eine vorherrschende Expression des myoepithelbeweglichen Zustands und einen möglichen Übergang von einfachen Myoepithelzellen zu mesenchymalen Fibroblasten.In unserer Studie wurde der Nachweis der Verschiebung der Myoepithelzellen zu einem mesenchymalen Phänotyp, der durch den Verlust der CK14-, CK5 / 6- und p63-Expression gezeigt wurde, durch die diskontinuierliche Markierung von Spindelzellen für Alpha-SMA verstärkt, ein Marker sowohl für Myoepithelzellen als auch für Myofibroblasten, der in sternförmig beweglichen Zellen, die angeblich zu Fibroblasten geworden sind, vollständig verloren ging.

Weitere Bestätigungsstudien von Tsuda et al. berichtete über das Auftreten von Myofibroblasten mit Resten der CK14-Expression (beschrieben als „konvertierte Myoepithelzellen“). In den in der vorliegenden Studie untersuchten Fällen verblasste CK14 progressiv, was auf einen Verlust des (myo-) epithelialen Phänotyps hindeutet. Diese Ergebnisse stützen die EMT-Hypothese mit einem myoepithelialen ähnlichen Zustand , der einen myoepithelialen mesenchymalen Übergang (MMT) durchläuft. Diese Hypothese wurde am Hund von Gärtner et al. die Who erklärte, dass bei Brusttumoren einer der Schritte in der Evolution mesenchymaler Zellen die Expression typischer myoepithelialer Merkmale beinhaltet.Ein interessantes Ergebnis der vorliegenden Studie war die Positivität in 12/29 suprabasalen Myoepithelzellen und 9/29 Sternzellen von Karzinomen in gutartig gemischten Tumoren und komplexen Karzinomen. Es wurden zwei Isoformen von ER-Rezeptoren beschrieben, nämlich ER-α und ER-β, wobei letzteres die einzige Form ist, die in den Kernen isolierter Basal-Myoepithelzellen exprimiert wird . Der in der vorliegenden Untersuchung verwendete Antikörper umfasste beide Isoformen: Sowohl luminale als auch basale / sternförmige Zellen wurden markiert, vermutlich luminale Zellen durch ER-α und basale / sternförmige Zellen durch ER-β.

Zusammenfassend wurden die suprabasalen Myoepithelzellen durch p63 und CK14 und in geringerem Maße durch den anderen verwendeten Marker gut charakterisiert. Die beweglichen Myoepithelzellen sind stattdessen durch Alpha-SMA und VIM und den Verlust von CK14, CK5 / 6 und p63 gekennzeichnet (Abbildung 2). Die vorliegende Studie zeigte auch ER sowohl in luminalen Epithelzellen als auch in suprabasalen / sternförmigen Myoepithelzellen (letztere in etwa der Hälfte der Fälle) und dass die ER-Expression nicht durch die Ruhe- / Bewegungsphase beeinflusst wird. Daher kann in seriellen oder mehrfarbigen Abschnitten die Immunhistochemie nach ER in Kombination mit p63 und CK14 dazu dienen, eine fehlerhafte Identifizierung von Luminal- oder Myoepithelzellen in Brusttumoren bei Hunden zu vermeiden. Der Trend der erhaltenen Alpha-SMA- und VIM-Expression in Spindelzellen, und nur VIM-Positivität in sternförmigen beweglichen Zellen sowie die verringerte p63-Expression in beiden beweglichen Typen, unterstützt die Hypothese der EMT mit einem myoepithelialen ähnlichen Zustand in MMT. Die spindelbewegliche Zelle könnte als eine frühere Transformation als die Sternzelle in Richtung eines mesenchymalen Phänotyps angesehen werden.

Beitrag der Autoren

Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagung

Die Autoren danken Frau Anne Collins für die Bearbeitung des englischen Textes.

Ergänzende Materialien