Gramnegative Bakterien haben wie die Energieorganellen von Pflanzen und Tieren (Chloroplasten und Mitochondrien) zwei Membrandoppelschichten, die als äußere und innere Membran bezeichnet werden. Der Raum zwischen diesen beiden Membranen wird als Periplasma bezeichnet. Lange vor einzelligen Eukaryoten entwickelte sich das Periplasma als erstes extrazytoplasmatisches Kompartiment, um eine wichtige kompetitive Anpassung an gramnegative Bakterien zu ermöglichen. Frühe Kenntnisse und die Entdeckung des Periplasmas entwickelten sich bereits vor seiner morphologischen Visualisierung. In den 1960er Jahren versuchten Wissenschaftler zu verstehen, wie toxische Enzyme, die am Abbau wichtiger biologischer Moleküle beteiligt sind, wie Ribonukleasen und Phosphatasen, die von den gramnegativen Bakterien Escherichia coli produziert werden, für die Zelle nicht toxisch sind. Biochemische Extraktionsmethoden schlugen ein separates Kompartiment vor, da eine solche Extraktion das innere membrangebundene Zytoplasma konservierte und diese Sphäroplasten wieder wachsen und mehr Enzyme synthetisieren konnten . Die Entwicklung der Elektronenmikroskopie führte zur Visualisierung der beiden durch das Periplasma getrennten Membrandoppelschichten .

Die zusätzliche Membran ermöglicht die Schaffung des Periplasmas als separates zelluläres Kompartiment, dessen neue Funktionen wahrscheinlich einen signifikanten und vielleicht sogar wichtigeren selektiven Vorteil als der Toxinausschluss bieten (Tabelle 1). Diese neuartigen Funktionen umfassen Proteintransport, Faltung, Oxidation und Qualitätskontrolle ähnlich dem eukaryotischen zellendoplasmatischen Retikulum. Das Periplasma ermöglicht auch die Sequestrierung von Enzymen, die im Zytoplasma toxisch sein können, wichtige Signalfunktionen und Zellteilungsregulation. Darüber hinaus trägt es zur Fähigkeit der Zelle bei, Turgordruck zu widerstehen, indem es strukturelle Systeme bereitstellt, die mit der äußeren Membran zusammenarbeiten, wie Peptidoglycan und Lipoproteine, Multidrug-Effluxsysteme und spezifische gelöste Stoffe, die zu einem Donnan- oder Ionenpotential über der äußeren Membran beitragen. Das Periplasma enthält auch die Montageplattformen, die an der Sekretion von einzigartig strukturierten Beta-Barrel-Proteinen, Lipoproteinen und Glycerolphospholipiden an die äußere Membran beteiligt sind (Abbildung 1).

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Abb. 1. Architektur der gramnegativen Bakterienzellhülle.

Dargestellt ist die asymmetrische Doppelschicht aus Lipopolysaccharid und Glycerolphospholipiden, die die äußere Membran bilden. Die innere Membran ist eine symmetrische Doppelschicht aus Glycerolphospholipiden. Der periplasmatische Raum ist der Bereich zwischen diesen Membranen, der eine Vielzahl von Enzymen und Funktionen umfasst, einschließlich der Oxidation und Qualitätskontrolle von Proteinen. Ebenfalls innerhalb des periplasmatischen Raums befindet sich eine Schicht aus vernetzten Zuckern und Aminosäuren, die als Peptidoglycan bezeichnet werden und die Zelle umgeben. Das Peptidoglycan ist in enterischen Bakterien durch kovalente Transpeptidase-Verknüpfungen zwischen einem reichlich vorhandenen äußeren Membranlipoprotein Lpp mit der äußeren Membran verbunden. Eine Vielzahl von Sensoren sitzen in der inneren Membran mit periplasmatischen Domänen, die Umweltveränderungen und im Fall des Rcs-Systems eine Änderung der Position des RCSF-Außenmembran-Lipoproteins erfassen. Mehrkomponenten-Proteinkomplexe wie die Flagellarmaschine überspannen die beiden Membranen. IM, innere Membran; Lpp, Brauns Lipoprotein; LPS, Lipopolysaccharid; RcsF, Regulator der Kapselsynthese F.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935.g001

Die äußere Membran ist eine einzigartige Organelle, die über das Periplasma mit anderen Teilen der Zellhülle verbunden ist. Grampositiven Bakterien fehlt eine äußere Membran, aber sie haben ein umfangreicheres Peptidoglycanpolymer, das ihre Oberfläche schützt. Im Gegensatz zur bakteriellen Innenmembran — einer Doppelschicht aus Glycerolphospholipiden, die der der meisten Säugetiermembranen ähnelt und einen spezifischen Fluss aufweist, der durch laterale Diffusion gekennzeichnet ist — weist die Außenmembran einen eingeschränkten Fluss auf . Es ist eine einzigartige Doppelschicht, wobei die innere Packungsbeilage einen typischen Glycerolphospholipidgehalt von Phosphotidylethanolamin, Phosphatidylglycerin und Cardiolipin aufweist und die äußere Packungsbeilage weitgehend aus einem einzigartigen Glycolipid, Lipopolysaccharid (LPS), besteht . Die LPS-Phosphate verleihen der Oberfläche eine negative Ladung, und ein spezifisches Donnan-Potential wird über die äußere Membran in das Periplasma erzeugt . Die äußere Membran fungiert als selektive Barriere, die den Transport wertvoller Nährstoffe ermöglicht und gleichzeitig eine Barriere gegen toxische Verbindungen wie kationische antimikrobielle Verbindungen darstellt, die von allen Organismen, einschließlich vieler grampositiver Bakterien, produziert werden . Eine weitere Komponente dieser Barriere sind äußere Membranproteine mit einer einzigartigen Beta-Barrel-Struktur, die durch ein spezifisches periplasmatisches Chaperonsystem in die äußere Membran eingeführt werden . Diese Proteine bauen sich in der äußeren Membran als spezifische Puncta zusammen, was darauf hinweist, dass sich die äußere Membran wahrscheinlich zu spezifischen diskreten Patches zusammensetzt, die Protein und die einzigartige asymmetrische Lipiddoppelschicht enthalten. Zu diesen äußeren Membranproteinen gehören die Porine, die als selektive Kanäle wirken können, die hydrophilen Substraten einer bestimmten Größe den Eintritt in das Periplasma ermöglichen. Zum Glück für den Menschen transportieren diese Porine hydrophile Beta-Lactam-Antibiotika, die ihr Eindringen in das Periplasma ermöglichen, wo sie auf die Synthese des wichtigen Strukturelements der Zellwand abzielen — des polymeren Peptidoglycans. Die äußere Membran einiger Bakterien ist durch reichlich vorhandene Lipoproteine am Peptidoglycanpolymer verankert, die durch spezifische Sekretionssysteme in das innere Faltblatt der äußeren Membran eingeführt werden . Eine Vielzahl wichtiger Proteinkomplexe fungiert als Nanomaschinen und nutzt die ATP-Hydrolyse, um Makromoleküle abzuscheiden oder eine Motilitätsorganelle, die Flagellen genannt wird, umzuwandeln . Daher sind die äußere Membran und die innere Membran auch über das Periplasma durch membranspannende Proteinkomplexe verbunden. Daher besteht die äußere Membran aus deutlich zusammengesetzten Pflastern, die eine komplexe Organelle umfassen, die durch kovalente und nichtkovalente Proteinverknüpfungen an die Peptidoglycanschicht und die innere Membran gebunden werden kann. Die Anordnung der äußeren Membran und ihre Verbindung zum Peptidoglycan und Zytoplasma schafft einen Raum zwischen der inneren Membran und der äußeren Membran, die das Periplasma ist.

Trotz der wichtigen Funktionen, die im periplasmatischen Raum enthalten sind, gibt es seit vielen Jahren Debatten über den Intermembranabstand oder die Größe dieses Kompartiments und darüber, ob der Abstand zwischen der inneren und der äußeren Membran in der gesamten Zelle einheitlich ist. Es gab Bedenken, dass viele der Visualisierungen dieses Raumes als von einer bestimmten Größe waren Artefakte der Fixierung für die Bildgebung durch Elektronenmikroskopie und dass, eigentlich, der Raum war eigentlich nur ein potentieller Raum. Die frühen elektronenmikroskopischen Studien von Bayer zeigten Adhäsionen zwischen der äußeren und der inneren Membran, die einen Teil dieser Räume auslöschten; Er schlug vor, dass Adhäsionspunkte Bereiche waren, in denen das Hauptlipid der äußeren Membran, LPS, von seiner Synthesestelle an der inneren Membran an die äußere Membran abgegeben wurde . Seine Arbeit wurde jedoch später als aus der Beobachtung potenzieller Fixierungsartefakte abgeleitet diskreditiert, obwohl viele Experten heute der Meinung sind, dass es echte proteinbasierte Adhäsionen zwischen den Membranen geben könnte, da einige Efflux- und Transportsysteme keine Komponenten mit ausreichenden Abmessungen enthalten, um den visualisierten Raum zu überspannen. Das Vorhandensein spezifischer Bereiche, in denen die Membranen nahe beieinander liegen, würde erklären, wie einige dieser ATP-bindenden Kassettentransport- und Effluxpumpen (ABC) funktionieren könnten; diese Systeme haben periplasmatische Proteinkomponenten, die für den Efflux-, LPS- oder anderen Glykolipidtransport essentiell sind, aber keine intrinsische Größe oder polymere Natur haben, die groß genug ist, um die äußere Membran zu erreichen und somit einen Mechanismus zur Förderung des Transports bereitzustellen. Darüber hinaus enthält das Periplasma viele andere Komponenten, die zumindest ein gewisses Volumen für den periplasmatischen Raum erfordern, am prominentesten die Peptidoglycan-Polymerschicht, die die Zelle umgibt. Gegenwärtig ist unklar, wie diese Transporter um dieses Polymer herumkommen und wie breit das Periplasma ist, um mit der Membran in Kontakt zu treten, obwohl neuere Arbeiten, die zeigen, dass Lipoproteine der äußeren Membran die Peptidoglycansynthese durch direkten Kontakt koordinieren können, darauf hindeuten, dass zumindest einige Proteine durch Poren in Peptidoglycan passen können, um wichtige Funktionen zu erfüllen

Im Gegensatz dazu erfordern eine Vielzahl von Organellen, einschließlich des Flagellums und des virulenzassoziierten Typ-III-Sekretionssystem-Nadelkomplexes, den Zusammenbau von Polymeren innerhalb des Periplasmas, die die beiden Membranen überspannen. Im Falle des Flagellums überspannt sein Stab oder seine Antriebswelle das Periplasma und seine Länge wird durch das Polymer bestimmt, das die äußere Membran kontaktiert. Eine neuere Arbeit der Gruppe von Kelly Hughes hat gezeigt, dass die Größe des Periplasmas oder der Abstand zwischen den beiden Membranen in enterischen Bakterien weitgehend durch ein spezifisches Lipoprotein namens Braun-Lipoprotein (oder Lpp) gesteuert wird, das die äußere Membran kovalent mit der Peptidoglycanschicht verbindet . Dies ist bemerkenswert, da Lpp das am häufigsten vorkommende Protein in enterischen Bakterien ist, das Braun vor 48 Jahren beschrieben hat, und bis zu diesem Zeitpunkt keine spezifische Funktion zugeschrieben wurde. Dieses alpha-helikale Protein wird durch seinen Lipidanker in das innere Faltblatt der äußeren Membran eingeführt und durch eine Familie von Transpeptidasen kovalent mit dem Peptidoglycanpolymer verbunden . Die Verlängerung dieser Lipoproteine, die eine Ausdehnung des Periplasmas ermöglichen, führt zu einem längeren Flagellenstab und einem effizienteren Schwimmverhalten. Diese Autoren interpretierten dieses Ergebnis als Hinweis darauf, dass es andere evolutionär ausgewählte Funktionen geben muss, die die periplasmatische Größe begrenzten und eine Verringerung der Schwimmeffizienz erzwangen. In dieser Ausgabe von PLOS Biology wird eine dieser wichtigen Funktionen aufgedeckt: eine Signalfunktion der Hüllenschädigung, die von einem anderen äußeren Membranlipoprotein, dem Regulator der Kapselsynthese F (RcsF), gesteuert wird, das eine Störung oder Beschädigung der Hülle erkennt.

Gramnegative Bakterien haben eine Vielzahl wichtiger Funktionen, die Membranschäden und toxische Verbindungen wie antimikrobielle Peptide erkennen, die die äußere Membran schädigen . Zu diesen Sensorsystemen gehören solche, die eine Umgestaltung der Bakterienoberfläche ermöglichen, um resistenter gegen toxische Verbindungen zu sein — analog zu Raumschiffen, die ihre Schilde in Science-Fiction-Geschichten mit Energie versorgen . Einige dieser Sensorsysteme sind Rezeptoren, die als Sensorkinasen mit Domänen im Periplasma fungieren, um bestimmte Moleküle oder Schäden zu erfassen. Eines der einzigartigeren Sensorkinasesysteme, das als Rcs—System bezeichnet wird und bei Membranschäden die Synthese von extrazellulärem Polysaccharid aktiviert, um zellulären Schutz und Biofilmbildung zu gewährleisten, weist jedoch ein äußeres Membran—Lipoprotein RcsF auf, das mit Signalproteinen mit spezifischen periplasmatischen Domänen bei Hüllschäden und Peptidoglycan-Stress interagiert, um die Synthese der extrazellulären Polysaccharidproduktion und anderer stressbedingter Bewältigungswege zu aktivieren . Somit bringt eine Hüllenschädigung das RcsF-Lipoprotein auf irgendeine Weise in eine größere Nähe zum inneren Membransensorsystem und führt somit zu einer Störung in der äußeren Membran und / oder im Peptidoglycan (Abb. 2). In dieser Ausgabe von PLOS Biology zeigen die Autoren schlüssig, dass diese Sensorik erfordert, dass das Periplasma eine bestimmte Größe hat, da Mutationen, die den hochreichlichen Lpp-Lipoprotein-Anker von der äußeren Membran zum Peptidoglycan verlängern (was zu einer erhöhten Größe des Periplasmas führt), die Signalübertragung aufheben, es sei denn, das Sensing-Lipoprotein (das bei Membranschäden zum inneren Membransensor reichen muss) wird ebenfalls verlängert . Diese Arbeit zeigt auch deutlich eine sehr spezifische Reihenfolge und Größe des Periplasmas; die Größe des Periplasmas ist deutlich zu erkennen, da es in Verbindung mit den Veränderungen der Lipoproteinverankerung oder -länge durch Kryoelektronenmikroskopie existiert. Diese Technologie und die Elektronentomographie, die in der Arbeit der Hughes-Gruppe in Bezug auf den Flagellenrotor verwendet werden, revolutionieren unsere Sicht auf die bakterielle Zellhülle und die Proteinkomplexe, die das Periplasma überspannen, um wichtige Funktionen zu erfüllen .

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Abb. 2. Die RcsF-Signalisierung wird durch eine Änderung der Größe des periplasmatischen Raums verändert.

Der Lipoproteinsensor der RCSF-Außenmembran muss seine Signalpartner der Innenmembran kontaktieren, um die Sensorik zu aktivieren. Diese Erfassung erfordert einen bestimmten periplasmatischen Abstand, da die Verlängerung der Lpp-Verknüpfungen zu Peptidoglycan den Abstand des Periplasmas vergrößert, und wenn RcsF nicht verlängert wird, kann keine Signalisierung mehr auftreten. In Panel A: Der Zustand, in dem RcsF keine Signalisierung aktiviert, da keine Hüllkurvenstörung vorliegt. Im Panel B: Hüllkurvenstörung führt zu physikalischen RCSF-Wechselwirkungen mit dem inneren Membransensorsystem, und das Rcs-Regulon wird aktiviert. In Panel C, in dem Lpp verlängert und der periplasmatische Intermembranabstand verlängert wurde, kann das Rcs-Regulon trotz Hüllkurvenstörung nicht aktiviert werden. In Panel D: Der Defekt des langen Lpp wird durch Verlängerung von RcsF korrigiert. IM, innere Membran; Lpp, Brauns Lipoprotein; OM, äußere Membran; PG, Peptidoglycan; RcsF, Regulator der Kapselsynthese F.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935.g002

Obwohl diese jüngsten Studien Lpp als ein spezifisches molekulares Lineal zwischen der äußeren Membran und Peptidoglycan definiert haben, ist nicht bekannt, was den Abstand zwischen der inneren Membran und Peptidoglycan reguliert und was die Polymerisation oder den Abbau des Peptidoglycan-Polymers steuert, so dass es Proteine, die das Periplasma überspannen, nicht vollständig blockiert. Die Definition dieser und anderer Geheimnisse der Zellhülle könnte zu wichtigen praktischen Fortschritten führen und unseren wissenschaftlichen Drang befriedigen, die Geheimnisse der gramnegativen bakteriellen Zellhülle zu lösen. Diese Hülle ist ein bemerkenswert effizientes und evolutionär fortschrittliches Molekularsieb, das die Entwicklung von Antibiotika gegen diese Organismen erheblich erschwert als für grampositive Bakterien, denen die zusätzliche Membran und das Periplasma fehlen.Ein besseres Wissen über die gramnegative Zellhülle ist auch für das Verständnis der Mechanismen der Antibiotikaresistenz von entscheidender Bedeutung, da viele unserer erfolgreichsten Antibiotika, einschließlich Beta-Lactam-Antibiotika (die auf Peptidoglycan abzielen und durch die Porine eindringen), auf die Zellhülle abzielen. Gramnegative Bakterien und multiresistente Organismen entwickeln sich durch Hüllmutationen und den Erwerb neuer periplasmatischer Enzyme weiter. Es gibt einen Mangel an neuen Antibiotika für gramnegative Bakterien in der Pipeline, da es schwierig ist, die einzigartige Barriere zu durchbrechen, die von der äußeren Membran und dem Periplasma bereitgestellt wird. In dieser Hinsicht haben Antibiotika mit periplasmatischen Zielen einen Vorteil gegenüber solchen, die mit den Schwierigkeiten konfrontiert sind, die innere Membran zu durchdringen und einen signifikanten Efflux zu vermeiden. Es ist interessant zu spekulieren, dass die Ausrichtung auf essentielle periplasmatische Funktionen, die ein Periplasma bestimmter Größe und Fähigkeit zur Aufnahme verschiedener Funktionen erfordern, wichtige neue Ziele für die Entwicklung von Antibiotika bieten könnte. Neuere Studien haben neue Grundfunktionen der gramnegativen Hülle durch bakterielle Genetik, Strukturbiologie und fortgeschrittene morphologische Techniken aufgedeckt. Trotz jahrzehntelanger Studien bleibt noch viel über die gramnegative bakterielle Zellhülle zu lernen. Die Aufdeckung anderer Geheimnisse in diesem Bereich sollte zu einer neuen Generation von Zielen für die Entwicklung von Antibiotika führen, um uns im Wettrüsten mit antibiotikaresistenten gramnegativen Bakterien einen Schritt voraus zu sein.