Aktivierung von RNase H

RNase H ist ein ubiquitäres Enzym, das den RNA–Strang eines RNA-DNA-Duplexes abbaut. Es wurde in so unterschiedlichen Organismen wie Viren und menschlichen Zellen identifiziert (Crouch und Dirksen, 1985). Mindestens zwei Klassen von RNase H wurden in eukaryotischen Zellen identifiziert. In Prokaryoten wurden mehrere Enzyme mit RNase H-Aktivität beobachtet (Crouch und Dirksen, 1985). Obwohl RNase H an der DNA-Replikation beteiligt ist, kann sie andere Rollen in der Zelle spielen und kommt sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vor (Crum et al., 1988). Es wird jedoch angenommen, dass die Konzentration des Enzyms im Zellkern größer ist, und ein Teil des Enzyms, das in zytoplasmatischen Präparaten gefunden wird, kann auf eine Kernleckage zurückzuführen sein.

Die genauen Erkennungselemente für RNase H sind nicht bekannt. Es wurde jedoch gezeigt, dass Oligonukleotide mit DNA-ähnlichen Eigenschaften, so kurz wie Tetramere, die RNase H aktivieren können (Donis-Keller, 1979). Veränderungen im Zucker beeinflussen die Aktivierung der RNase H, da Zuckermodifikationen, die zu RNA-ähnlichen Oligonukleotiden führen, z. B. 2′-Fluor oder 2′-methoxy, nicht als Substrate für die RNase H zu dienen scheinen (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). Veränderungen in der Orientierung des Zuckers zur Base können auch die Aktivierung der RNase H beeinflussen, da α-Oligonukleotide keine RNase H induzieren können oder ein paralleles Annealing erfordern (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Darüber hinaus beeinflussen Rückgratmodifikationen die Fähigkeit von Oligonukleotiden, RNase H zu aktivieren. Methylphosphonate aktivieren die RNase H nicht (Maher et al., 1989; Müller, 1989). Im Gegensatz dazu sind Phosphorthioate ausgezeichnete Substrate (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein und Cheng, 1993). Darüber hinaus wurden chimäre Moleküle als Oligonukleotide untersucht, die an RNA binden und RNase H aktivieren (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Beispielsweise binden Oligonukleotide, die aus Flügeln von 2′-Methoxyphosphonaten und einer Fünf-Basen-Lücke von Desoxyoligonukleotiden bestehen, an ihre Ziel-RNA und aktivieren die RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein einzelnes Ribonukleotid in einer Sequenz von Desoxyribonukleotiden ausreicht, um als Substrat für RNase H zu dienen, wenn es an sein komplementäres Desoxy-Oligonukleotid gebunden ist (Eder und Walder, 1991).

Dass es möglich ist, chimäre Oligonukleotide zu nutzen, die RNase H aktivieren und eine größere Affinität zu ihren RNA-Rezeptoren aufweisen und die Spezifität erhöhen, wurde ebenfalls gezeigt (Giles und Tidd, 1992; Monia et al., 1993). In einer Studie war die RNase H-vermittelte Spaltung des Zieltranskripts viel selektiver, wenn Desoxyoligonukleotide, die aus Methylphosphonat-Desoxyoligonukleotidflügeln und Phosphodiesterlücken bestanden, mit vollständigen Phosphodiesteroligonukleotiden verglichen wurden (Giles und Tidd, 1992).

Trotz der Informationen über RNase H und der Demonstration, dass viele Oligonukleotide RNase H in Lysat- und gereinigten Enzymtests aktivieren können, ist noch relativ wenig über die Rolle von Strukturmerkmalen in RNA-Zielen bei der Aktivierung von RNase H bekannt (Minshull und Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder und Walder, 1988). Tatsächlich fehlte bis vor kurzem ein direkter Beweis dafür, dass die Aktivierung von RNase H tatsächlich der Wirkungsmechanismus von Oligonukleotiden in Zellen ist.

Aktuelle Studien in unseren Laboren liefern zusätzliche, wenn auch indirekte Einblicke in diese Fragen. ISIS 1939 ist ein 20 mer Phosphorthioat komplementär zu einer Sequenz in der 3′-untranslatierten Region der ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Es hemmt die ICAM-Produktion in menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen und Northern Blots zeigen, dass ICAM-1-mRNA schnell abgebaut wird. Ein 2′-Methoxy-Analogon von ISIS 1939 zeigt eine höhere Affinität zur RNA als das Phosphorthioat, ist in Zellen stabil, hemmt aber die ICAM-1-Proteinproduktion viel weniger stark als ISIS 1939. Es ist wahrscheinlich, dass ISIS 1939 die RNA destabilisiert und die RNase H aktiviert. Im Gegensatz dazu hemmte ISIS 1570, ein 18-mer-Phosphorthioat, das zum Translationsinitiationscodon der ICAM-1-Nachricht komplementär ist, die Produktion des Proteins, verursachte jedoch keinen Abbau der RNA. So hatten zwei Oligonukleotide, die in der Lage sind, RNase H zu aktivieren, unterschiedliche Wirkungen in Abhängigkeit von der Stelle in der mRNA, an die sie gebunden haben (Chiang et al., 1991). Eine direktere Demonstration, dass RNase H wahrscheinlich ein Schlüsselfaktor für die Aktivität vieler Antisense-Oligonukleotide ist, wurde durch Studien erbracht, in denen die Reverse-Ligations-PCR verwendet wurde, um Spaltprodukte aus Bcrabl-mRNA in Zellen zu identifizieren, die mit Phosphorthioat-Oligonukleotiden behandelt wurden (Crooke et al., 1995).

Angesichts der aufkommenden Rolle chimärer Oligonukleotide mit Modifikationen in den 3′- und 5′-Flügeln, die die Affinität zur Ziel-RNA und die Nukleasestabilität verbessern sollen, und einer Lücke vom DNA-Typ, die als Substrat für RNase H dient, sind Studien, die sich auf das Verständnis der Auswirkungen verschiedener Modifikationen auf die Effizienz des Enzyms (der Enzyme) konzentrieren, ebenfalls von erheblicher Bedeutung. In einer solchen Studie an E. coli RNase H haben wir berichtet, dass das Enzym eine minimale Sequenzspezifität aufweist und prozessiv ist. Wenn ein chimäres Oligonukleotid mit 2′- modifizierten Zuckern in den Flügeln an die RNA hybridisiert wurde, war die anfängliche Spaltstelle das Nukleotid neben dem Methoxy-Deoxy-Übergang, der dem 3′-Ende des RNA-Substrats am nächsten liegt. Die anfängliche Spaltungsrate nahm mit zunehmender Größe der DNA-Lücke zu und die Effizienz des Enzyms war gegenüber einem mit einem chimären Antisense-Oligonukleotid duplexierten RNA-Ziel erheblich geringer als bei einem vollständigen DNA-Oligonukleotid (Crooke et al., 1995).

In nachfolgenden Studien haben wir die Wechselwirkungen von Antisense-Oligonukleotiden mit strukturierten und unstrukturierten Targets und die Auswirkungen dieser Wechselwirkungen auf RNase H genauer untersucht (Lima und Crooke, 1997). Mit einer Reihe von nicht spaltbaren Substraten und Michaelis-Menten-Analysen konnten wir sowohl die Bindung als auch die Spaltung bewerten. Wir haben gezeigt, dass E. coli RNase H1 tatsächlich ein Doppelstrang-RNA-Bindungsprotein ist. Die Kd für den RNA-Duplex betrug 1,6 µM, die Kd für einen DNA-Duplex 176 µM und die Kd für Einzelstrang-DNA 942 µM. Im Gegensatz dazu konnte das Enzym RNA nur in einem RNA-DNA-Duplex spalten. Jede 2′-Modifikation des Antisense-Wirkstoffs an der Schnittstelle hemmte die Spaltung, aber eine signifikante Ladungsreduktion und 2′-Modifikationen wurden an der Bindungsstelle toleriert. Schließlich reduzierte das Platzieren einer positiven Ladung (z. B. 2′-Propoxyamin) in dem Antisense-Arzneimittel Affinität und Spaltung. Wir haben auch die Auswirkungen von Antisense-Oligonukleotid-induzierten RNA-Strukturen auf die Aktivität von E. coli RNase H1 untersucht (Lima und Crooke, 1997). Es wurde festgestellt, dass jede Struktur im Duplexsubstrat einen signifikanten negativen Effekt auf die Spaltungsrate hat. Ferner wurde die Spaltung ausgewählter Stellen vollständig gehemmt, und dies wurde durch eine sterische Behinderung erklärt, die durch die RNA-Schleife verursacht wurde, die entweder die Neben- oder Hauptrillen oder den Heteroduplex durchquerte. Vor kurzem haben wir menschliche RNase H1 kloniert und exprimiert. Das Protein ist homolog zur E. coli RNase H1, hat aber ähnliche Eigenschaften wie die für humane RNase H Typ 2 beschriebene (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). Das Enzym wird durch niedrige Konzentrationen von Mg2 + stimuliert, durch höhere Konzentrationen gehemmt und durch Mn2 + in Gegenwart von Mg2 + gehemmt. Es ist 33 kDa im Molekulargewicht. Es ist doppelsträngiges RNA-Bindungsprotein und weist einzigartige Positions- und Sequenzpräferenzen für die Spaltung auf (Wu et al., 1999). Zusätzlich wurde die humane RNase H2 kloniert, aber bisher wurde nicht gezeigt, dass das exprimierte Protein aktiv ist (Frank et al., 1998). In jüngster Zeit haben wir über die Auswirkungen mehrerer in die humane RNase H1 eingeführter Mutationen auf die Aktivität des Enzyms berichtet (Wu et al., 2000). So haben wir jetzt die notwendigen Werkzeuge, um die Rolle der humanen RNase H in biologischen und pharmakologischen Prozessen zu erforschen und Medikamente zu entwickeln, die effektiver mit ihnen interagieren.

Schließlich haben wir zumindest im Hinblick auf den RNase H-induzierten Abbau von Ziel-RNA kürzlich gezeigt, dass im Bereich von 1-150 Kopien von RNA pro Zelle der Gehalt an Ziel-RNA keinen Einfluss auf die Wirksamkeit von Antisense-Inhibitoren hat (Miraglia, 2000). Dies liegt an der Tatsache, dass die Anzahl der Moleküle des Antisense-Arzneimittels pro Zelle die Anzahl der Kopien der RNA um mehrere Größenordnungen übersteigt. Daher müssen andere Faktoren ratenbegrenzend sein.