Aptamere haben sich aufgrund ihrer breiten Anwendung von der Biosensorik bis zur Therapeutik als neuartige Kategorie auf dem Gebiet der Biorezeptoren herausgestellt. Es wurden mehrere Variationen ihres Screening-Prozesses, SELEX genannt, berichtet, die Sequenzen mit gewünschten Eigenschaften ergeben können, die für ihre endgültige Verwendung erforderlich sind.

Erzeugen von einzelsträngigen Oligonukleotidbibliothekbearbeiten

Der erste Schritt von SELEX beinhaltet die Synthese von vollständig oder teilweise randomisierten Oligonukleotidsequenzen einiger Länge, flankiert von definierten Regionen, die eine PCR-Amplifikation dieser randomisierten Regionen und im Fall von RNA-SELEX eine In-vitro-Transkription der randomisierten Sequenz ermöglichen. Während Ellington und Szostak in ihrer Arbeit von 1990 über In-vitro-Selektion zeigten, dass die chemische Synthese in der Lage ist, ~ 1015 einzigartige Sequenzen für Oligonukleotidbibliotheken zu erzeugen, fanden sie heraus, dass die Amplifikation dieser synthetisierten Oligonukleotide zu einem signifikanten Verlust der Pool-Diversität aufgrund von PCR-Bias und Defekten in synthetisierten Fragmenten führte. Der Oligonukleotidpool wird amplifiziert und eine ausreichende Menge der Ausgangsbibliothek wird der Reaktion hinzugefügt, so dass zahlreiche Kopien jeder einzelnen Sequenz vorhanden sind, um den Verlust potenzieller Bindungssequenzen aufgrund stochastischer Ereignisse zu minimieren. Bevor die Bibliothek zur Inkubation und selektiven Retention in das Ziel eingeführt wird, muss die Sequenzbibliothek in einzelsträngige Oligonukleotide umgewandelt werden, um strukturelle Konformationen mit Zielbindungseigenschaften zu erreichen.

Target-Inkubationbearbeiten

Unmittelbar vor der Einführung des Targets wird die einzelsträngige Oligonukleotidbibliothek häufig langsam erhitzt und abgekühlt, um Oligonukleotide in thermodynamisch stabile Sekundär- und Tertiärstrukturen zu renaturieren. Nach der Herstellung wird die randomisierte Bibliothek mit immobilisiertem Target inkubiert, um eine Oligonukleotid-Target-Bindung zu ermöglichen. Es gibt mehrere Überlegungen für diesen Zielinkubationsschritt, einschließlich der Zielimmobilisierungsmethode und Strategien für die nachfolgende ungebundene Oligonukleotidtrennung, Inkubationszeit und -temperatur, Inkubationspufferbedingungen und Ziel- gegenüber-Oligonukleotidkonzentrationen. Beispiele für Zielimmobilisierungsmethoden umfassen Affinitätschromatographiesäulen, Nitrozellulosebindungsassayfilter und paramagnetische Perlen. Kürzlich wurden SELEX-Reaktionen entwickelt, bei denen das Ziel ganze Zellen sind, die nahe der vollständigen Konfluenz expandierten und mit der Oligonukleotidbibliothek auf Kulturplatten inkubiert wurden. Inkubationspufferbedingungen werden basierend auf dem beabsichtigten Ziel und der gewünschten Funktion des ausgewählten Aptamers geändert. Bei negativ geladenen kleinen Molekülen und Proteinen werden beispielsweise hochsalzige Puffer für das Ladungsscreening verwendet, damit sich Nukleotide dem Ziel nähern und die Wahrscheinlichkeit eines spezifischen Bindungsereignisses erhöhen können. Wenn die gewünschte Aptamerfunktion in vivo Protein- oder Ganzzellbindung für eine potenzielle therapeutische oder diagnostische Anwendung ist, erzeugen Inkubationspufferbedingungen, die in vivo Plasmasalzkonzentrationen und homöostatischen Temperaturen ähneln, eher Aptamere, die in vivo binden können. Eine weitere Überlegung bei Inkubationspufferbedingungen sind unspezifische Konkurrenten. Wenn eine hohe Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Oligonukleotidretention unter den Reaktionsbedingungen besteht, können unspezifische Konkurrenten, die andere kleine Moleküle oder Polymere als die SELEX-Bibliothek sind, die ähnliche physikalische Eigenschaften wie die Bibliotheksoligonukleotide aufweisen, verwendet werden, um diese unspezifischen Bindungsstellen zu besetzen. Die Variation der relativen Konzentration von Target und Oligonukleotiden kann auch die Eigenschaften der ausgewählten Aptamere beeinflussen. Wenn eine gute Bindungsaffinität für das ausgewählte Aptamer kein Problem darstellt, kann ein Überschuss an Target verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass zumindest einige Sequenzen während der Inkubation binden und erhalten bleiben. Dies bietet jedoch keinen selektiven Druck für eine hohe Bindungsaffinität, was erfordert, dass die Oligonukleotidbibliothek im Überschuss ist, so dass eine Konkurrenz zwischen einzigartigen Sequenzen um verfügbare spezifische Bindungsstellen besteht.

Bindungssequenz Elution und Amplifikationbearbeiten

Sobald die Oligonukleotidbibliothek mit dem Target für ausreichende Zeit inkubiert wurde, werden ungebundene Oligonukleotide vom immobilisierten Target weggewaschen, oft unter Verwendung des Inkubationspuffers, so dass spezifisch gebundene Oligonukleotide zurückgehalten werden. Wenn ungebundene Sequenzen weggewaschen werden, werden die spezifisch gebundenen Sequenzen dann eluiert, indem denaturierende Bedingungen geschaffen werden, die die Oligonukleotid-Entfaltung oder den Verlust der Bindungskonformation fördern, einschließlich des Fließens in entionisiertem Wasser, unter Verwendung von denaturierenden Lösungen, die Harnstoff und EDTA enthalten, oder durch Anwendung hoher Hitze und physikalischer Kraft. Nach Elution gebundener Sequenzen werden die zurückgehaltenen Oligonukleotide im Falle von RNA oder modifizierter Basenauswahl reverse-transkribiert an DNA oder im Falle von DNA-SELEX einfach zur Amplifikation gesammelt. Diese DNA-Templates aus eluierten Sequenzen werden dann über PCR amplifiziert und in einzelsträngige DNA, RNA oder modifizierte Basenoligonukleotide umgewandelt, die als Ausgangsinput für die nächste Selektionsrunde verwendet werden.

Erhalt von ssDNAEdit

Einer der kritischsten Schritte im SELEX-Verfahren ist die Gewinnung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) nach dem PCR-Amplifikationsschritt. Dies wird als Input für den nächsten Zyklus dienen, daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass die gesamte DNA einzelsträngig ist und so wenig wie möglich verloren geht. Wegen der relativen Einfachheit ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden die Verwendung von biotinylierten Reverse-Primern im Amplifikationsschritt, wonach die komplementären Stränge an ein Harz gebunden werden können, gefolgt von Elution des anderen Strangs mit Lauge. Eine andere Methode ist die asymmetrische PCR, bei der der Amplifikationsschritt mit einem Überschuss an Vorwärtsprimer und sehr wenig Rückwärtsprimer durchgeführt wird, was zur Produktion von mehr des gewünschten Strangs führt. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass das Produkt von doppelsträngiger DNA (dsDNA) und anderem übrig gebliebenem Material aus der PCR-Reaktion gereinigt werden sollte. Der enzymatische Abbau des unerwünschten Strangs kann durchgeführt werden, indem dieser Strang mit einem Phosphat-sondierten Primer markiert wird, wie er von Enzymen wie Lambda-Exonuklease erkannt wird. Diese Enzyme bauen dann selektiv den phosphatmarkierten Strang ab und lassen den komplementären Strang intakt. Alle diese Methoden stellen ungefähr 50 bis 70% der DNA wieder her. Für einen detaillierten Vergleich siehe den Artikel von Svobodová et al. wo diese und andere Methoden experimentell verglichen werden. In klassischem SELEX wird der oben beschriebene Prozess der randomisierten Erzeugung einer einzelsträngigen Bibliothek, der Zielinkubation und der Elution und Amplifikation der Bindungssequenz wiederholt, bis die überwiegende Mehrheit des zurückgehaltenen Pools aus Zielbindungssequenzen besteht, obwohl es häufig verwendete Modifikationen und Ergänzungen des Verfahrens gibt, die nachstehend erörtert werden.

Negative oder Gegenselektionbearbeiten

Um die Spezifität von Aptameren zu erhöhen, die durch ein gegebenes SELEX-Verfahren ausgewählt werden, kann vor oder unmittelbar nach der Zielinkubation ein negativer Selektions- oder Gegenselektionsschritt hinzugefügt werden. Um Sequenzen mit Affinität zu Zielimmobilisierungsmatrixkomponenten aus dem Pool zu eliminieren, kann eine negative Selektion verwendet werden, bei der die Bibliothek mit Zielimmobilisierungsmatrixkomponenten inkubiert wird und ungebundene Sequenzen erhalten bleiben. Negative Selektion kann auch verwendet werden, um Sequenzen zu eliminieren, die zielähnliche Moleküle oder Zellen binden, indem die Oligonukleotidbibliothek mit niedermolekularen Zielanaloga, unerwünschten Zelltypen oder Nichtzielproteinen inkubiert und die ungebundenen Sequenzen beibehalten werden.

Verfolgung des Selektionsfortschrittsbearbeiten

Um den Fortschritt einer SELEX-Reaktion zu verfolgen, kann die Anzahl der an das Ziel gebundenen Moleküle, die der Anzahl der eluierten Oligonukleotide entspricht, mit der geschätzten Gesamtmenge an Oligonukleotiden nach der Elution in jeder Runde verglichen werden. Die Anzahl der eluierten Oligonukleotide kann durch Elutionskonzentrationsschätzungen über 260 nm Wellenlängenabsorption oder Fluoreszenzmarkierung von Oligonukleotiden geschätzt werden. Wenn sich die SELEX-Reaktion dem Abschluss nähert, nähert sich der Anteil der Oligonukleotidbibliothek, der das Ziel bindet, 100%, so dass sich die Anzahl der eluierten Moleküle der Schätzung des gesamten Oligonukleotideinsatzes nähert, aber bei einer niedrigeren Anzahl konvergieren kann.

Vorbehalte und Überlegungen

Einige SELEX-Reaktionen können Sonden erzeugen, die für die Sekundärstrukturbildung von Primerbindungsregionen abhängig sind. Es gibt Aptamer-Anwendungen, für die eine kurze Sequenz und damit Primertrunkierung wünschenswert ist. Eine Weiterentwicklung der ursprünglichen Methode ermöglicht es einer RNA-Bibliothek, die konstanten Primerregionen wegzulassen, die nach dem Selektionsprozess schwer zu entfernen sein können, da sie Sekundärstrukturen stabilisieren, die instabil sind, wenn sie allein durch die zufällige Region gebildet werden.