la matriz Extracelular de la preparación y la reología

El ECM está compuesto de una red de gelatina y fibrina. Para preparar los componentes de ECM, se produce primero una solución de gelatina de 15 wt/v% (Tipo A, 300 bloom de piel porcina, Sigma) agregando gelatina en polvo a una solución tibia (70 °C) de DPBS (1 SOLUCIÓN salina tamponada de fosfato de Dulbelco sin calcio y magnesio). Se deja que la gelatina se disuelva por completo agitando durante 12 h a 70 °C, y luego se ajusta el pH a 7,5 utilizando 1 M de NaOH. La solución se filtra estéril y se almacena a 4 °C en alícuotas para su uso posterior en fundición (<3 meses). Se produce una solución de fibrinógeno (50 mg / ml) disolviendo proteína plasmática de sangre bovina liofilizada (Milipora) a 37 °C en DPB estériles sin calcio ni magnesio. La solución se mantiene a 37 °C sin agitación durante al menos 45 minutos para permitir la disolución completa. La solución de transglutaminasa (TG) (60 mg/ml) se prepara disolviendo polvo liofilizado (Moo Gloo) en DPBS sin calcio y magnesio y mezclando suavemente durante 20 segundos. La solución se mantiene a 37 °C durante 20 minutos y se filtra estéril antes de usarla. Se prepara una solución madre de CaCl2 (250 mm) disolviendo el polvo de CaCl2 en DPBS sin calcio ni magnesio (Corning). Para preparar la solución madre de trombina, la trombina liofilizada (Sigma Aldrich) se reconstituye a 500 U/ml utilizando DPB estériles y se almacena a -20 °C. Las alícuotas de trombina se descongelan inmediatamente antes de su uso.

Para las mediciones de reología de tinta se utiliza un reómetro de tensión controlada (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) con un diámetro de 40 mm, un cono de 2° y una geometría de placa. Los módulos de almacenamiento de cizallamiento (G’) y pérdida (G») se miden a una frecuencia de 1 Hz y una deformación oscilatoria (γ) de 0,01. Los barridos de tiempo se realizan colocando rápidamente una solución de MCE premezclada que contiene trombina en la placa Peltier a 37 °C.

Formulaciones de tinta

Se requieren dos tintas para la bioimpresión 3D de modelos de TP perfusables. Una tinta, que se utiliza para crear la junta de la viruta de perfusión, está compuesta por un elastómero de silicona de dos partes (SE 1700, DOW Chemical) con una base de 10:1 a catalizador (por peso) que se homogeniza utilizando un mezclador centrífugo durante 2 min (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Japón). La tinta de silicona se imprime a las 2 h de la mezcla con el catalizador. Esta tinta se carga en una jeringa (EFD Inc., East Providence, RI) y centrifugado para eliminar cualquier burbuja de aire antes de imprimir a temperatura ambiente. La otra tinta, una tinta fugitiva utilizada para imprimir el túbulo, está compuesta de F127 plurónico al 38% en peso (Sigma) y 100 U/ml de trombina en agua desionizada y ultrafiltrada (DIUF). La tinta fugitiva se tiñe de rosa mediante la adición de un tinte de reactor de riesgo para visualización en la Fig. 1 y Película S1. Para preparar esta tinta, se homogeneiza una solución plurónica F127 al 40% en peso en agua con una mezcladora fina hasta que el polvo se disuelva por completo, y posteriormente se almacena a 4 °C. Antes de su uso, se agrega una solución de trombina de 2000 U/mL a la tinta fugitiva (Plurónica) en una proporción de 1:20, y se homogeneiza con una mezcladora fina. La tinta fugitiva se carga en una jeringa (EFD Inc., East Providence, RI) a 4 °C y centrifugado para eliminar cualquier burbuja de aire. Antes de imprimir, esta tinta se equilibra a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos.

Bioimpresión de estructuras de túbulos proximales 3D perfusables

Las construcciones de PT 3D se fabrican utilizando una bioimpresión 3D multimaterial diseñada a medida equipada con cuatro cabezales de impresión direccionables de forma independiente montados en un pórtico de 3 ejes controlado por movimiento con un volumen de construcción de 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Las tintas se alojan en jeringas separadas a las que se unen boquillas de tamaño variable (es decir, de 50 µm a 410 µm de diámetro) a través de un luer–lock (EFD Inc., East Providence, RI, estados UNIDOS). Las tintas se extruyen a través de boquillas de deposición mediante la aplicación de presión de aire (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, EE. UU.), que van desde 10-90 psi, correspondientes a velocidades de impresión entre 1 mm/s y 5 cm/s. Primero imprimimos la junta de chip de perfusión personalizada depositando la tinta de silicona a través de una boquilla cónica de 410 µm en portaobjetos de vidrio de 50 mm × 75 mm. El diseño de la junta se crea utilizando un script MATLAB personalizado que genera código G para una estructura de junta final. Después de la impresión, la junta de la viruta de perfusión se cura a 80 °C en un horno durante >1 h y se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

El modelado de PTs 3D dentro del chip de perfusión requiere una combinación de fundición del ECM e impresión de la tinta fugitiva. En primer lugar, la solución ECM se crea combinando 10 mg/ml de fibrinógeno, gelatina al 7,5% en peso, CaCl2 de 2,5 mM y TG de 0,2% en peso. Esta solución se equilibra a 37 °C durante 15-20 minutos antes de su uso para mejorar la claridad óptica de la ECM25. A continuación, la solución se mezcla rápidamente con trombina en una proporción de 500:1, lo que da como resultado una concentración final de trombina de 1 U/ml. En 2 minutos a 37 ° C, se produce la polimerización del fibrinógeno en gel de fibrina. Por esta razón, la solución de MCE debe fundirse en la base del chip de perfusión inmediatamente después de mezclarse con trombina. La capa de ECM de base se deja secar ligeramente bajo nitrógeno, de modo que forma una superficie plana. La tinta plurónica fugitiva F127 (con trombina de 100 U / mL) se imprime en la capa de ECM de base en forma de filmamento enrevesado (túbulo) utilizando una boquilla cónica de 200 µm. Se utiliza un script Python personalizado (MeCode) para especificar la ruta de herramientas en G-code. Directamente después de la impresión de tinta fugitiva, los pasadores de perfusión huecos metálicos interconectados a través de la junta de silicona entran en contacto con la tinta impresa. Luego se forma una capa superior de ECM fundiendo la solución de ECM sobre el túbulo impreso, como se describió anteriormente, a 1-2 mm de la altura de las paredes de la junta. Si las células, como HNDFs, se incorporan en el ECM (Fig. S5), se mezclan directamente después del período de equilibrio, antes de la mezcla de trombina y posterior colada. Después de fundir la capa superior de ECM, la construcción se cubre con un portaobjetos de vidrio para evitar la evaporación o la contaminación y se mantiene a 37 °C durante 1 h para permitir que la polimerización de fibrina termine y TG reticule la red. La construcción se enfría a 4 °C durante 15-20 minutos para licuar la tinta fugitiva impresa, que se elimina del dispositivo utilizando medios de celda fría, dejando conductos abiertos que sirven como la red tubular deseada incrustada dentro de la MCE con o sin celdas en el espacio extratubular de la MCE.

Usando este método, también producimos arquitecturas 3D en una secuencia de compilación capa por capa. Por ejemplo, cada capa individual de la estructura de tres capas que se muestra en la Fig. S10 se ha construido utilizando un protocolo de impresión modificado que incorpora los materiales y métodos previamente discutidos. Después de imprimir los primeros túbulos con tinta fugitiva, se coloca una capa de ECM sobre la impresión y se permite que se gelifiquen 20 minutos a 37 °C antes de que la siguiente capa proximal de túbulos se imprima con tinta fugitiva encima de la capa recientemente gelificada. Esta construcción sucesiva introduce geometría 3D y permite la evacuación exitosa de todos los canales de forma independiente después de la construcción. Los tintes de reactor de riesgo de base acuosa se perfunden a través de los canales y se excitan con luz UV para su visualización.

Para completar el proceso de ensamblaje de chips de tejido 3D, cada construcción PT se coloca sobre una base de acero inoxidable mecanizada y se coloca una tapa de acrílico gruesa en la parte superior. La tapa y la base están unidas por cuatro tornillos, formando un sello alrededor de la junta de silicona impresa. A continuación, un tubo peristáltico estéril de dos pasos (BPT PharMed, diámetro interno de 0,25 mm) se llena con medios y se conecta a la salida de un filtro estéril que se une a un cilindro de jeringa de 10 ml (EFD Nordson), que sirve como depósito de medios. Medios PTEC (diseñados para el crecimiento, por lo que la formulación ATCC más 1% de FBS, 1% de aprotinina y 1% de anti-anti) que se han equilibrado durante >3 h en una incubadora a 37 °C, se agrega un 5% de CO2 al depósito de medios y los tubos del depósito se conectan a la salida del chip (pasador de perfusión hueco de metal). Luego se utiliza una jeringa para ejercer una ligera presión sobre el medio en el barril, forzándolo a entrar y llenar completamente el tubo adjunto. Llenar el tubo con medios antes de conectarlo al circuito evita la introducción de burbujas de aire en el sistema. Para completar el circuito de perfusión, se conecta un tubo de silicona del depósito al pasador de perfusión de metal de entrada en el chip. Se agregan abrazaderas de presión de manguera en la entrada y salida del chip de perfusión para evitar el flujo incontrolado cuando se desconecta de la bomba peristáltica, que puede dañar el epitelio o permitir que entren burbujas de aire en el sistema. El depósito de medios se equilibra en todo momento con las condiciones atmosféricas en la incubadora mediante un filtro estéril en la parte superior del depósito de medios.

Cultivo celular

Los PTEC inmortalizados humanos (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) se cultivan según las instrucciones de ATCC y se utilizan para todos los estudios de modelos de PT hasta el pasaje 20. Para el análisis de expresión génica, se utilizan y cultivan células cancerosas renales RPTEC primarias humanas (Ciencia celular), PTEC inmortalizadas (RPTEC-TERT1, Evercyte) y A498 (ATCC HTB-44) según las instrucciones del proveedor. Los fibroblastos dérmicos neonatales humanos (HNDF), expresión de GFP (Angio-Proteomia) se cultivan según las instrucciones del proveedor y se usan hasta el pasaje 15.

Análisis de expresión génica

Las células de cáncer renal de RPTEC primario humano (Ciencia celular), RPTEC-TERT1 inmortalizado (Evercyte) y A498 (ATCC HTB-44) se cultivan en placas de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del proveedor y se recolectan en el Día 3 después de la confluencia reemplazando el medio de cultivo con 100 µl/pocillo de 1 mezcla de lisis de ARN (Kit de Procesamiento de muestras de Quantigen, QS0101). A continuación, se mezclan 40 µl de lisado con un conjunto de esferas magnéticas de captura de ARNm (Panomics Quantigen Plex Set 12631, número de catálogo 312631), se incuban durante la noche, se procesan para amplificación de ADN ramificado y se analizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Panomics Quantigen Plex Assay kit, QP1015). La sonda PPIB se utiliza como gen de limpieza para la normalización. Los datos de Intensidad de fluorescencia (FI) se presentan como desviación promedio y estándar de 3 réplicas biológicas.

Análisis de citocinas de perfusionado de medios

El perfusionado de medios se recoge de un túbulo durante un período de 25 días después de la siembra celular y se almacena a -80 °C antes del análisis. Para el perfilado de citoquinas, los sobrenadantes se descongelan en hielo, se diluyen 2 veces en tampón de dilución de muestra (catálogo BioRad #M60-009RDPD) y se analizan mediante ELISA basada en tecnología Luminex utilizando la Quimiocina Humana Bio-Plex Pro™ IL-6 (Conjunto #171BK29MR2), IL-8 (Conjunto #171-BK31MR2) y MCP-1 (Conjunto #171-BK36MR2) y el Bio-Plex 200 Sistemas (BioRad) según las instrucciones del fabricante. Los datos se presentan como concentraciones medias de citoquinas y desviaciones estándar de triplicados técnicos.

Epitelización y cultivo longitudinal

Cada construcción de PT 3D se perfunde durante varias horas con medios PTEC en la incubadora antes de la carga/siembra celular. Los PTEC (PTEC / TERT1, ATCC) se tripsinizan de su plato de cultivo y se concentran en medios a ~2 × 107 células/ml. A continuación, la suspensión celular se carga en el chip de perfusión a través de la salida (Fig. S3b, c). La construcción cargada se coloca lateralmente en la incubadora durante varias horas y se voltea 180° en el transcurso de múltiples intervalos de media hora para permitir una siembra uniforme de las paredes del túbulo, luego se incuba en el túbulo sin flujo durante la noche. Al día siguiente, las células no adherentes se eliminan del túbulo bajo flujo por gravedad. Luego se inicia la perfusión de medios frescos y las células restantes comienzan a agruparse y luego crecen a partir de esas colonias (Fig. S3f) hasta que alcancen la confluencia alrededor de 3 semanas después de la siembra (Fig. S3k). Durante la fase de crecimiento, los PTEC se alimentan con medios PTEC preparados según las pautas de ATCC más un 1% de aprotinina (Milipora de EMD, utilizada para ralentizar la degradación de la ECM), un 1% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco). Después de la maduración, se elimina el FBS y los PTEC se empaquetan en una monocapa epitelial apretada (Película S2). En el día 1 después de la siembra, los PTEC se exponen a un flujo continuo unidireccional a 1 µl/min, lo que equivale a tensiones de cizallamiento que varían entre 0,1 y 0,5 dinas/cm2 dependiendo de la sección transversal del túbulo. El medio se alimenta a través de una bomba peristáltica en un circuito cerrado y se cambia cada 2 días.

Estudio de captación de albúmina

La captación de albúmina se evalúa para los modelos impresos de PT en 3D, así como para los controles en 2D. El primer control consiste en PTEC cultivados en plástico de cultivo de tejidos, mientras que el segundo control consiste en PTEC cultivados en nuestra ECM. En cada caso, los PTEC se cultivan hasta la confluencia y se dejan madurar en medios libres de suero. La albúmina sérica humana conjugada con FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) se suspende en medios PTEC a 50 µg/ml. Todas las muestras se incuban con HSA-FITC en sus medios durante 2 h (en el caso de perfusión, se perfunde a través del lumen abierto). Después de la exposición, todas las muestras se lavan con un volumen de 3x y luego se tripsinizan con 10x tripsina para recoger las células individuales. Las células se fijan y se contra tiñen con anticuerpos primarios y secundarios para megalin (la Tabla S2 enumera los anticuerpos específicos utilizados). Las células de esas muestras, y las células desnudas, se analizan mediante citometría de flujo (BD LSR Fortessa) y se recopilan datos de n = 10.000 células por muestra. Para obtener imágenes de HSA-FITC y megalin en PTECs, las muestras se fijan en su lugar con formalina en lugar de ser trisinizadas después del paso de lavado. Esas muestras se colorean contra para megalin y se obtienen imágenes mediante microscopía confocal (Zeiss LSM710).

Prueba de ciclosporina A

Se explora el efecto de la AsiA en los controles 2D y en el PTs 3D bioimprimido. En 2D, las células se siembran en un formato de 96 pocillos en plástico de cultivo de tejidos y se cultivan hasta la confluencia. Son medios de alimentación según las directrices de ATCC. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) se suspende en sus medios a diversas concentraciones y se incuba con células durante 24 h. Se realiza un ensayo de viabilidad utilizando(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) en presencia de metosulfato de fenazina (MTS) a las 24 h después de la exposición. Este ensayo se completa en PTECs en la confluencia temprana, al dar a las células CysA el día en que alcanzaron la confluencia, así como la confluencia tardía, al dar a CysA varios días después de que alcanzaron la confluencia. En particular, los resultados de toxicidad son similares para cada caso (Fig. 5n). Para los TPs 3D, la AsiA se alimenta a diversas concentraciones a través de la luz abierta de los túbulos maduros después de alcanzar la confluencia (en la marca de ~3 semanas), donde no se incluye suero en el medio durante un mínimo de 10 días. En la marca de 24 h después de la exposición a la AISS, se realiza una prueba de fugas FITC-dextrano (descrita a continuación) para evaluar y cuantificar las perturbaciones en la función de barrera de los PTEC. A continuación, el TP se fija con formalina tamponada al 10% durante 1 h y se mantiene en contraste para actina y DAPI (en la Tabla S2 se enumeran los tintes específicos utilizados).

Mediciones de permeabilidad difusora

Para evaluar la función de barrera del epitelio en 3D, la permeabilidad difusora se cuantifica perfundiendo medios PTEC en el lumen abierto que contienen 25 µg/ml de dextrano de 70 kDa conjugado con FITC (FITC-Dex, producto Sigma 46945) a una velocidad de 15 µL/min durante 3 min y 1 µL / min a partir de entonces durante ~30-45 min. La prueba completa se realiza bajo imágenes de células vivas con el túbulo y la MEC circundante en el campo de visión (Fig. S9). El patrón de difusión de FITC-Dex se detecta utilizando un microscopio fluorescente de campo amplio (Zeiss Axiovert 40 CFL). Las imágenes de fluorescencia se capturan antes de la perfusión y cada 3 a 5 minutos durante un período de 30 a 45 minutos. La permeabilidad difusional de FITC-Dex se calcula cuantificando los cambios en la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo utilizando la siguiente ecuación34;

Pd es el coeficiente de permeabilidad difusional, I1 es la intensidad media en un punto de tiempo inicial, I2 es una intensidad media en t ~ 30-45 min, Ib es la intensidad de fondo (imagen tomada antes de la perfusión de FITC-Dex), y d es el diámetro del canal. Otros investigadores han informado que los PTEC pueden reabsorber dextran39, lo que conduciría a valores ligeramente más altos para la permeabilidad difusora medida.

También investigamos las propiedades de barrera de nuestros túbulos revestidos epiteliales utilizando un compuesto de bajo peso molecular, la inulina (4,5 kDa) que no es reabsorbida ni secretada in vivo por PTECs utilizando el mismo método descrito anteriormente. Específicamente, la inulina-FITC (producto Sigma F3272) se disuelve en medios PTEC calentados a 100 µg/ml y se perfunde en el lumen abierto a una velocidad de 20 µL/min durante 3 min y 1,5 µL/min a partir de entonces durante ~15 min. La prueba completa se realiza bajo imágenes de células vivas con el túbulo y la MEC circundante en el campo de visión (Fig. S7). El patrón de difusión de FITC-inulina se detecta utilizando un microscopio fluorescente de campo amplio (Leica). Las imágenes de fluorescencia se capturan con una fuente de luz cerrada y una etapa controlada por movimiento antes de la perfusión y cada 3 a 5 minutos durante el período de 15 minutos para recopilar mediciones técnicas por triplicado.

Microscopía electrónica

Para microscopía electrónica de transmisión (TEM), PTEC en arquitecturas 2D o 3D o tejido renal humano sano obtenido de una biopsia estándar antes del trasplante se fijan utilizando glutaraldehído al 2,5%, paraformaldehído al 1,25% y ácido pícrico al 0,03% en tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M (pH 7,4) durante un mínimo de varias horas. Se extraen muestras pequeñas (1 mm × 1 mm) y se lavan en tampón de cacodilato de 0,1 M y se bañan en osmiumtetroxide (OsO4) al 1% (EMS) y 1.Ferrocianuro de potasio al 5% (KFeCN6) (Sigma) durante 1 h, lavado en agua 3 veces e incubado en acetato de uranilo acuoso al 1% (EMS) durante 1 h seguido de 2 lavados en agua y posterior deshidratación en diferentes grados de alcohol (10 min cada uno; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Luego, las muestras se colocan en propilenóxido (EMS) durante 1 h y se incuban durante la noche en una mezcla 1:1 de propilenóxido y TAAB Epon (Marivac Canada Inc. San Lorenzo, Canadá). Al día siguiente, las muestras se incrustan en TAAB Epon y se polimerizan a 60 °C durante 48 h. Las secciones ultrafinas (aproximadamente 60 nm) se cortan en un microtomo Reichert Ultracut-S, se colocan en rejillas de cobre teñidas con citrato de plomo y se examinan en un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1200EX y las imágenes se graban con una cámara CCD AMT 2k. El análisis de imágenes se realiza utilizando el software ImageJ.

Para microscopía electrónica de barrido (SEM), los PTEC perfundidos en 3D se fijan utilizando formalina tamponada al 10% durante 1 h. Las muestras se cortan finamente (~1 mm de espesor) para exponer las células que circunscriben el lumen abierto. El fijador se lava con PBSx2 y la deshidratación posterior en diferentes grados de etanol (20 minutos cada uno; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). A continuación, las muestras se colocan en etanol al 50% y hexametildisilazano al 50% (HMDS) durante 30 minutos, seguido de HMDS al 100% 3 × 30 minutos. Todos los pasos se realizan en un recipiente de vidrio cerrado y sellado. Después del lavado final con HMDS, las muestras se retiran y se colocan en un recipiente abierto bajo N2 en la campana extractora para que se sequen. Las muestras secas se montan en soportes de pasadores de aluminio con cinta de carbono conductora, pulverización catódica recubierta con oro y se obtienen imágenes con un SEM Vega de Tescan.

Inmunotinción

La inmunotinción seguida de microscopía confocal se utiliza para evaluar la localización celular de proteínas en modelos PTEC 2D y 3D. Antes de la inmunotinción, cada constructo se lava con PBS y luego se fija durante 20 min a 1 h con formalina tamponada al 10%. El fijador se retira usando varios lavados en PBS durante varias horas y luego se bloquea durante la noche utilizando 1% en peso de albúmina sérica bovina (ASC) en PBS. Los anticuerpos primarios a la proteína celular o biomarcador de interés se incuban con los constructos durante 1 día a las diluciones enumeradas en la Tabla S2 en una solución de 0,5% en peso de ASC y 0,125% en peso de Tritón X-100. La eliminación de anticuerpos primarios no unidos se realiza utilizando un paso de lavado contra una solución de PBS o 0,5% en peso de ASC y 0,125% en peso de Triton X-100 en PBS durante 1 día. Los anticuerpos secundarios se incuban con los constructos durante 1 día a las diluciones enumeradas en la Tabla S2 en una solución de 0,5% en peso de ASC y 0,125% en peso de Tritón X-100 en PBS. Las muestras se tiñen con adhesivo NucBlue o ActinGreen durante 2 h y luego se lavan durante 1 día en PBS antes de la toma de imágenes.

Renderización y análisis de imágenes

La microscopía de contrato de fase se realiza utilizando un visor Leica DM IL invertido con objetivos que van de 1,25 X a 40X. La microscopía confocal se realiza utilizando un Zeiss LSM 710 vertical con objetivos de inmersión en agua que van de 5X a 40X empleando láseres espectrales a longitudes de onda de 405, 488, 514, 561 y 633 nm. Las reconstrucciones de imágenes de pilas z se realizan en ImageJ utilizando la función de proyección z con el ajuste de intensidad máxima de píxeles. Cualquier aumento de brillo se realiza de manera uniforme en toda una imagen proyectada en z. Las reconstrucciones de imágenes en 3D y las películas giratorias (Movie S3) se realizan utilizando el software Imaris. El nuevo sistema de incubadora de CytoSMART (Lonza) se utiliza para capturar imágenes de lapso de tiempo (Película S2). El análisis de imágenes para la cuantificación de la permeabilidad difusora se realiza utilizando scripts MATLAB personalizados que emplean métodos informados previamente34. El análisis de imágenes TEM se realiza utilizando el software ImageJ para medir la altura de la celda (n ≥ 50), la densidad de las microvellosidades (n ≥ 25) y la longitud de las microvellosidades (n ≥ 150) en al menos 3 muestras independientes para cada condición.

análisis Estadístico

los Datos se expresan como medias ± desviación estándar. El análisis estadístico se realiza utilizando MATLAB y la significación estadística se determina a un valor de p < 0,05 determinado por un ANOVA utilizando la prueba de comparación de pares múltiples de Tukey. Los diferentes niveles de significación (valores de p) se indican con asteriscos y los valores de p específicos se proporcionan en la leyenda de cada figura.