Sujetos del estudio, muestras clínicas y genotipado de HLA. Todos los sujetos con antecedentes de transfusión de sangre fueron excluidos del estudio. Treinta y dos familias con antecedentes de esclerodermia simple fueron reclutadas y estudiadas para alelos HLA clase II y clase I; se estudiaron 3 generaciones para 20 familias y 2 generaciones para 12 familias. Se requerían tres generaciones para el ingreso al estudio de todas las mujeres con hijos, y la participación de todos los hijos era necesaria porque el microquimerismo podía derivarse de la madre o de un hijo en estas materias. La participación de hombres, niños y mujeres que nunca estuvieron embarazadas incluyó 2 generaciones (es decir, el sujeto y la madre). Un paciente con esclerodermia era un gemelo; el gemelo no afectado también fue reclutado para el estudio. Se reclutaron treinta y tres familias de control sanas, incluidas 22 con 3 generaciones y 11 con 2 generaciones. Se completó el genotipado de HLA para un total de 254 individuos: 128 en familias de esclerodermia y 126 en controles. Se incluyeron algunos familiares adicionales para confirmar la asignación de haplotipos de HLA. A partir de esta base de datos, se seleccionaron sujetos para un estudio adicional cuando la madre del sujeto tenía un alelo HLA no compartido que fue objetivo de ensayos específicos de HLA. Todos los sujetos otorgaron el consentimiento informado aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson.

Se aislaron PBMC de sangre heparinizada completa mediante dilución en HBSS, seguida de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) a 1,077 g/ml. Para algunos niños, se extrajo ADN de las raíces del cabello para tipificar HLA como se describió anteriormente (9). El ADN genómico se extrajo de PBMCs utilizando un Kit de Extracción Nucleica Isoquick (Orca Research Inc., Bothell, Washington, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y resuspendido en Tris-HCl de 10 mM (pH 9,0). La cantidad y pureza del ADN se determinaron mediante métodos espectrofotométricos estándar. Para algunos sujetos, el ADN se extrajo directamente de muestras de sangre completa.Se utilizó la tipificación basada en ADN con paneles de sonda de oligonucleótidos de secuencia específica para identificar alelos específicos en los loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 y DQB1. Para DRB1, un ensayo inicial de baja resolución detecta las familias DRB1 DBR1 * 01 a DRB1 * 14 y es seguido por 1 o más ensayos de alta resolución que identifican alelos DRB1 específicos como se describió anteriormente (10, 11). Los alelos DQA1 y DQB1 se determinaron utilizando métodos similares a los descritos anteriormente (9), con sondas adicionales agregadas para detectar alelos recién identificados (12). Los antígenos HLA clase I se determinaron mediante un ensayo estándar de linfocitotoxicidad que discrimina 20 antígenos HLA-A, 30 HLA-B y 8 antígenos HLA-Cw. Algunas muestras se sometieron a secuenciación para determinar alelos específicos de clase I de HLA (13). Para confirmar la asignación de alelos y antígenos de HLA y la homocigosis, se genotiparon varios miembros de la familia, incluidos los padres y hermanos de los sujetos, cuando estaban disponibles.

Cebadores PCR específicos de HLA. Las secuencias de imprimación se diseñaron en base a todas las secuencias de alelos conocidas (12). La síntesis de imprimación fue realizada por Oligos, Etc. (Wilsonville, Oregón, Estados Unidos). Un conjunto de imprimaciones fue diseñado para apuntar a un polimorfismo de clase I de HLA y 3 polimorfismos de clase II de HLA dirigidos. Para atacar el HLA-B44, se diseñó un cebador que amplifica un grupo de alelos HLA-B basado en polimorfismos en las posiciones 66, 69 y 75 del exón 3 y otro grupo de alelos HLA-B basado en un polimorfismo en la posición 229 del exón 3. La combinación de cebadores amplifica específicamente los alelos HLA-B44, produciendo un fragmento de 190 pb. Todos los cebadores específicos de DRB fueron diseñados para amplificar grupos de alelos basados en polimorfismos de secuencia en la región hipervariable del exón 2. Para HLA-DRB5*01, un primer amplifica un grupo de alelos DRB5*01 basado en polimorfismos en las posiciones 25, 26, 31, 32 y 38, y el otro amplifica un grupo de alelos DRB5*01 basado en polimorfismos entre las posiciones 215 y 231. La combinación de cebadores amplifica específicamente los alelos HLA-DRB5 * 01, produciendo un fragmento de 210 pb. Para HLA-DRB1*04, una imprimación amplifica un grupo de alelos DRB1*04 basados en polimorfismos en las posiciones 25, 26, 31 y 36, y la otra amplifica un grupo de alelos DRB1*04 basados en polimorfismos en las posiciones 97 y 110. La combinación de cebadores amplifica específicamente DRB1 * 04, produciendo un fragmento de 104 bp. Se logró una mayor discriminación entre los alelos DRB1*04 utilizando el primer anterior junto con 1 de 2 cebadores que discriminan un dimorfismo en la posición 258 (codón 86), produciendo un fragmento de 263-bp. Para HLA-DRB1 * 11, una imprimación amplifica un grupo de alelos DRB1 * 11 basados en polimorfismos en posiciones 25, 26, 28, 30, 31, 32, y 35 del exón 2, y el segundo cebador amplifica un grupo de alelos DRB1 * 11 basados en polimorfismos en las posiciones 173 y 174 del exón 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 50 µL que contenía 1,25–1,5 µg de ADN genómico, 10 mmol/L de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L de KCl, 1,5 mmol MgCl2, gelatina al 0,001% en peso/vol, 260 µmol/L de cada desoxinucleótido, Potenciador de PCR de coincidencia perfecta de 0,5 U (Stratagene, La Jolla, California, EE.Polimerasa de ADN dorada (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.) y 20 pmol de cada imprimación específica de HLA. Se añadió agua ultrapura para obtener el volumen final de 50 µL. La amplificación consistió en 5 minutos a 96°C, 35 ciclos a 95°C durante 35 segundos, y a 65°C durante 35 segundos para HLA-B44 (58,5°C para DRB5*01; 72°C para DRB1*04; 64,5°C para DRB1*11), luego 72°C durante 1 minuto, con un paso de extensión final a 72°C durante 10 minutos. Se logró una amplificación, sensibilidad y especificidad óptimas mediante la titulación de MgCl2, las concentraciones de imprimación, el número de termociclos y la temperatura de recocido. Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador GeneAmp System 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La sensibilidad del ensayo se determinó mediante experimentos de enriquecimiento en los que el ADN diana se diluyó en serie y se añadió a una cantidad fija de ADN de fondo correspondiente a los alelos del sujeto. Los ensayos de PCR específicos de HLA-B44 y DRB5*01 fueron capaces de detectar al menos 1 célula diana en un fondo de 500.000 células; los ensayos de PCR específicos de HLA– DRB1*04 y DRB1*11 fueron capaces de detectar al menos 1 célula diana en un fondo de 100.000 células. Cada ensayo de PCR incluyó los siguientes controles: (a) un control positivo del ADN de una línea celular con el alelo de interés HLA (0,2–0,5 µg); b) un control positivo de la madre del sujeto (0,2–0,5 µg); c) controles negativos de ADN de una línea celular con los mismos alelos HLA que el sujeto (1,25 µg y 0,35 µg); y d) un control negativo consistente en todos los reactivos para PCR sin ADN. Los productos de PCR se electroforizaron a una tensión constante de 100 V durante 1 hora en geles TBE prefabricados de 6% u 8% utilizando una minicélula Novex Xcell II (Novex, San Diego, California, EE.UU.). Cada gel incluía controles de PCR positivos y negativos y una escalera de 100 bp (SLL-100; Gensura, Del Mar, California, EE.UU.). Los geles fueron teñidos con tinción de plata (Kit Silver Stain Plus, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, EE. UU.) y se secó con el Sistema de Secado en Gel DryEase (Novex). El ADN extraído de sangre total se analizó en 4 muestras de cantidad insuficiente para aislar PBMCS. Todas las pruebas se realizaron por duplicado, y la mayoría de las muestras se analizaron más de una vez.

Medidas de precaución PCR. Se empleó extrema precaución para evitar y detectar la posible contaminación por PCR. Se utilizaron áreas separadas para la separación de PBMC, extracción de ADN genómico, configuración y amplificación de PCR, y análisis de productos de PCR, con pruebas de PCR antes y después realizadas en laboratorios separados. Puntas de pipeta resistentes a aerosoles (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, California, EE.UU.) se utilizaron en todos los experimentos, y se incluyeron múltiples controles negativos en todas las amplificaciones de PCR.

Secuenciación de productos de PCR específicos para HLA. Siete microlitros del producto de PCR específico de HLA inicial se sometieron a 40 ciclos adicionales de amplificación utilizando los parámetros de termociclado originales. Treinta microlitros de este producto de PCR se electroforizaron en un gel de agarosa ultrapura al 1,75% (GIBCO BRL, Grand Island, Nueva York, EE.UU.) y se teñieron con una solución de bromuro de etidio (0,5 µg/ml). La banda fue extirpada, eluida y purificada usando un Kit de Extracción de gel QIAquick (QIAGEN Inc. En Valencia , California, estados UNIDOS). El producto de PCR purificado se eluyó en 30 µL de 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0), y 100 ng se añade a una mezcla de reacción que contiene 8.0 µL de secuenciación de reactivos pre-mix (Thermo Sequenase; Amersham Corp, Arlington Heights, Illinois, estados UNIDOS), 12.imprimación de 5 pmol 5′ o 3′ y DMSO de 1 µL (Sigma Chemical Co. En saint Louis, Missouri, estados UNIDOS). Se añadió agua ultrapura para obtener un volumen final de 20 µL. Las mezclas de reacción de secuenciación se calentaron a 96 ° C durante 3 minutos en un termociclador GeneAmp System 9600, seguido de 25 ciclos a 96°C durante 10 segundos, 50°C durante 5 segundos y 60°C durante 4 minutos. Los productos de PCR resultantes se purificaron en columna y se electroforizaron como se indicó anteriormente. Las secuencias sensoriales y antisentido se determinaron por duplicado para los productos de PCR específicos de HLA del sujeto y de la madre, así como para los productos de PCR de líneas celulares de control positivo. El análisis de secuencias se realizó con el software Wisconsin Package versión 9.1 de Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, EE. UU.).

Preparación de portaobjetos de citospina e hibridación in situ. Se analizaron preparaciones de portaobjetos de citospina para detectar la presencia de secuencias específicas de los cromosomas X e Y, utilizando una técnica desarrollada en el Laboratorio de Citogenética Molecular del Centro de Investigación Oncológica Fred Hutchinson para el análisis cuantitativo del quimerismo en pares de trasplantes de células madre que no coinciden con el sexo (14). Se prepararon muestras de citospina de células masculinas mediante centrifugación de 30.000 a 60.000 PBMC recién separados en portaobjetos de vidrio, 300 µL por portaobjeto. Los portaobjetos se almacenaron en una cámara de desecación hasta su uso. La sonda específica para el cromosoma X DXZ1 (15) se tradujo por nick con digoxigenina, y la sonda específica para el cromosoma Y DYZ1 (16) se tradujo por nick con biotina. La mezcla de sonda XY tuvo una concentración final de 0,5 µg / ml de cada sonda en tampón de hibridación de formamida al 50%, 2× SSC (cloruro de sodio de 0,3 M y citrato de sodio de 0,03 M) y sulfato de dextrano al 10%. Se desnaturalizó a 72 ° C durante 5 minutos, se enfrió en hielo y se aplicó al portaobjetos. Los portaobjetos se digirieron en pepsina (0,1 mg/ml en 0.01 M de HCl) a 37°C durante 3 minutos, fijado en formalina tamponada al 4% durante 15 minutos, enjuagado en PBS, deshidratado en etanol (70%, 95% y 100%) y secado al aire. Los portaobjetos se desnaturalizaron mediante tratamiento en 2 × SSC (72°C) durante 10 minutos, formamida al 70%, 2× SSC (72°C) durante 3 minutos, se deshidrataron en una serie de etanol (-20°C) y se secaron al aire. Se aplicaron diez microlitros de sonda al portaobjetos y luego se montaron debajo de un cubreobjetos (22 × 22 mm) sellado con cemento de goma. Se incubó durante la noche a 42 ° C en una cámara humidificada. Los portaobjetos se lavaron en formamida al 55%, 2× SSC (45°C) durante 15 minutos y 2× SSC (temperatura ambiente) durante 5 minutos. Se detectaron simultáneamente señales de sonda con anti-digoxigenina acoplada a fluoresceína (dilución 1:500; Bioquímicos de Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) y avidina acoplada a rojo de Texas (dilución 1:500; Laboratorios Vectoriales, Burlingame, California, EE. UU.) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después del lavado con 2 × SSC y PBS, se montaron con VECTASHIELD (Laboratorios Vectoriales). Los portaobjetos se evaluaron directamente utilizando un microscopio de epifluorescencia Nikon E600 con una lámpara de mercurio de 100 W equipada con filtros de paso de banda simple, doble y triple adecuados. Solo se enumeraron células con 2 señales cromosómicas visibles, sin utilizar ningún realce electrónico.