Un método altamente eficiente de transferencia de genes a células de mamíferos es a través de la infección con vectores retrovirales. La eficiencia de la infección retroviral se mejora significativamente, de 100 a 1.000 veces en algunas células, al incluir polibreno durante la infección. El polibreno con choque DMSO también se usa para mediar la transferencia de ADN a una variedad de tipos de células, como CHO, fibroblastos de embriones de pollo, NINH-3T3 y células mieloides. Protocolo: Las reservas retrovirales recombinantes de infección retroviral se preparan agregando 5 ml de medio de crecimiento con un 5% de suero a una monocapa casi confluente de células de embalaje retrovirales transfectadas en una placa de 100 mm. Después de 24 horas, el medio se retira y se filtra a través de un filtro de 0,45 um. Las células que se infectan con este material retroviral recombinante se platean a 500.000 células por placa de 100 mm en 10 ml de medio completo. 24 horas después, retire el medio de crecimiento de las células. Infectar las células con 2 ml del sobrenadante viral (o una dilución del virus en 2 ml) en presencia de 5 a 10 g de polibreno por ml (concentración final). Incubar las células durante 3 a 6 horas a 37 ° C. Añadir 8 ml de medio completo. Tres días después de la infección, divida las células 1:5 en un medio de selección. Toyoshima, K. and Vogt, P. K., 1969. Virología. 38: 414-426 Coelen, J. R., Jose, D. G. and May, J. T. 1983. Arco. Virol. Protocolo 75: 307-311: Transfección de células en placas a una confluencia de aproximadamente el 50% en un medio de crecimiento completo. 18 a 24 horas después del recubrimiento, prepare la solución de polibreno en medio de ADN, inmediatamente antes de usarla de la siguiente manera: Nota: Cada componente debe agregarse en la secuencia adecuada.
1er: Medio de crecimiento completo (2 ml para una placa de 60 mm y 3 ml para una placa de 100 mm) calentado a 37 ° C.
2do: ADN plásmido, 10 ng a 10 g. Mezclar suavemente.
3º: Polibreno a una concentración final de 5 a 10 g por ml. Mezcle suavemente
Retire el medio de la placa y agregue la solución de polibreno de Medio de ADN a las células. Incubar las células a 37°C durante 6 a 20 horas con movimientos suaves ocasionales aproximadamente cada 1.5 horas durante las primeras 6 horas. Retire la solución de polibreno de medio de ADN y superponga suavemente las células con la solución de choque DMSO (15% DMSO en 1X HBSS: Catálogo de medios especiales #S-051-D) 3 ml por plato de 60 mm y 4 ml por plato de 100 mm. Mueva manualmente el plato durante 10 segundos para distribuir uniformemente la solución, y luego incube las células durante exactamente 4 minutos a 37°C. Retire inmediatamente la solución de choque DMSO y enjuague suavemente las células dos veces con medio de crecimiento completo, 5 ml por lavado por plato de 60 mm, 10 ml por lavado por plato de 100 mm Agregue medio de crecimiento completo a las células.
Para transformantes estables, retire el medio de crecimiento y divida las células 1:5 en medio de selección. Para la expresión transitoria, retire el medio de crecimiento y agregue un medio de crecimiento fresco. Células de cosecha y / o medio después de 24 a 72 horas. Chaney, W. G. et al., 1986. Genética Celular Somática y Molecular. Vol. 12, No. 23,
237-244. Aubin, R. J. et al. 1988. Genética Celular Somática y Molecular. Vol. 14, Nº 2, 155-167. Chisholm, O. et al., 1998. Investigación de Ácidos Nucleicos. Vol. El reactivo 16, No. 5, 2352
se suministra filtrado a través de membranas de 0,2 um e hidratado con H20 estéril.