Los aptámeros han surgido como una categoría novedosa en el campo de los biorreceptores debido a sus amplias aplicaciones que van desde la biosensura hasta la terapéutica. Se han reportado varias variaciones de su proceso de cribado, llamado SELEX, que pueden producir secuencias con las propiedades deseadas necesarias para su uso final.

Generación de una biblioteca de oligonucleótidos monocatenarioseditar

El primer paso de SELEX implica la síntesis de secuencias de oligonucleótidos total o parcialmente aleatorias de alguna longitud flanqueadas por regiones definidas que permiten la amplificación por PCR de esas regiones aleatorias y, en el caso del ARN SELEX, la transcripción in vitro de la secuencia aleatoria. Mientras Ellington y Szostak demostraron que la síntesis química es capaz de generar ~1015 secuencias únicas para bibliotecas de oligonucleótidos en su artículo de 1990 sobre selección in vitro, encontraron que la amplificación de estos oligonucleótidos sintetizados condujo a una pérdida significativa de diversidad de piscinas debido al sesgo de PCR y defectos en los fragmentos sintetizados. El grupo de oligonucleótidos se amplifica y se agrega una cantidad suficiente de la biblioteca inicial a la reacción para que haya numerosas copias de cada secuencia individual para minimizar la pérdida de secuencias de unión potenciales debido a eventos estocásticos. Antes de introducir la biblioteca en target para incubación y retención selectiva, la biblioteca de secuencias debe convertirse en oligonucleótidos monocatenarios para lograr conformaciones estructurales con propiedades de unión de target.

Incubación del objetivo

Inmediatamente antes de la introducción del objetivo, la biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios a menudo se calienta y enfría lentamente para renaturalizar los oligonucleótidos en estructuras secundarias y terciarias termodinámicamente estables. Una vez preparada, la biblioteca aleatoria se incuba con blanco inmovilizado para permitir la unión de oligonucleótidos a blanco. Hay varias consideraciones para esta etapa de incubación objetivo, incluido el método de inmovilización objetivo y las estrategias para la posterior separación de oligonucleótidos no unidos, el tiempo y la temperatura de incubación, las condiciones tampón de incubación y las concentraciones objetivo frente a oligonucleótidos. Ejemplos de métodos de inmovilización de objetivos incluyen columnas de cromatografía de afinidad, filtros de ensayo de unión de nitrocelulosa y perlas paramagnéticas. Recientemente, se han desarrollado reacciones SELEX donde el objetivo son células enteras, que se expanden cerca de la confluencia completa y se incuban con la biblioteca de oligonucleótidos en placas de cultivo. Las condiciones del tampón de incubación se modifican en función del objetivo previsto y de la función deseada del aptámero seleccionado. Por ejemplo, en el caso de moléculas pequeñas y proteínas con carga negativa, se utilizan tampones con alto contenido de sal para el cribado de carga para permitir que los nucleótidos se acerquen al objetivo y aumenten la probabilidad de un evento de unión específico. Alternativamente, si la función deseada del aptámero es la unión a proteínas in vivo o a células enteras para una posible aplicación terapéutica o diagnóstica, es más probable que las condiciones tampón de incubación similares a las concentraciones de sal plasmática in vivo y las temperaturas homeostáticas generen aptámeros que pueden unirse in vivo. Otra consideración en las condiciones de tampón de incubación son los competidores no específicos. Si hay una alta probabilidad de retención de oligonucleótidos no específicos en las condiciones de reacción, los competidores no específicos, que son moléculas pequeñas o polímeros distintos de la biblioteca SELEX que tienen propiedades físicas similares a los oligonucleótidos de la biblioteca, se pueden usar para ocupar estos sitios de unión no específicos. Variar la concentración relativa de objetivos y oligonucleótidos también puede afectar las propiedades de los aptámeros seleccionados. Si una buena afinidad de unión para el aptámero seleccionado no es una preocupación, entonces se puede usar un exceso de objetivo para aumentar la probabilidad de que al menos algunas secuencias se unan durante la incubación y se retengan. Sin embargo, esto no proporciona presión selectiva para una alta afinidad de unión, lo que requiere que la biblioteca de oligonucleótidos esté en exceso para que haya competencia entre secuencias únicas para sitios de unión específicos disponibles.

Elución y amplificacióneditar

Una vez que la biblioteca de oligonucleótidos se ha incubado con el objetivo durante un tiempo suficiente, los oligonucleótidos no unidos se eliminan del objetivo inmovilizado, a menudo utilizando el tampón de incubación para que los oligonucleótidos específicamente unidos se retengan. Con las secuencias no ligadas eliminadas, las secuencias específicamente ligadas se eluyen creando condiciones de desnaturalización que promueven el despliegue de oligonucleótidos o la pérdida de conformación de unión, incluido el flujo en agua desionizada, utilizando soluciones de desnaturalización que contienen urea y EDTA, o aplicando calor elevado y fuerza física. Tras la elución de secuencias enlazadas, los oligonucleótidos retenidos se transcriben al ADN en el caso del ARN o selecciones de bases modificadas, o simplemente se recogen para amplificación en el caso del SELEX de ADN. Estas plantillas de ADN a partir de secuencias eluidas se amplifican a través de PCR y se convierten en ADN de cadena simple, ARN o oligonucleótidos de base modificados, que se utilizan como entrada inicial para la siguiente ronda de selección.

Obtención de ADNSSEDITAR

Uno de los pasos más críticos en el procedimiento SELEX es la obtención de ADN monocatenario (ADNss) después de la etapa de amplificación de PCR. Esto servirá como entrada para el próximo ciclo, por lo que es de vital importancia que todo el ADN esté monocatenario y que se pierda lo menos posible. Debido a la relativa simplicidad, uno de los métodos más utilizados es el uso de cebadores inversos biotinilados en la etapa de amplificación, después de lo cual las hebras complementarias se pueden unir a una resina seguida de la elución de la otra hebra con lejía. Otro método es la PCR asimétrica, donde el paso de amplificación se realiza con un exceso de imprimación delantera y muy poca imprimación inversa, lo que conduce a la producción de más de la hebra deseada. Un inconveniente de este método es que el producto debe purificarse a partir de ADN de doble cadena (dsDNA) y otro material sobrante de la reacción PCR. La degradación enzimática de la hebra no deseada se puede realizar etiquetando esta hebra utilizando una imprimación con sondeo de fosfato, ya que es reconocida por enzimas como la exonucleasa Lambda. Estas enzimas degradan selectivamente la hebra marcada con fosfato, dejando intacta la hebra complementaria. Todos estos métodos recuperan aproximadamente del 50 al 70% del ADN. Para una comparación detallada, consulte el artículo de Svobodová et al. donde estos y otros métodos se comparan experimentalmente. En SELEX clásico, el proceso de generación aleatoria de bibliotecas de una sola cadena, incubación de objetivos y elución y amplificación de secuencias de enlace descrito anteriormente se repite hasta que la gran mayoría del grupo retenido consiste en secuencias de enlace de objetivos, aunque hay modificaciones y adiciones al procedimiento que se usan a menudo, que se discuten a continuación.

Selección negativa o contraeditar

Con el fin de aumentar la especificidad de los aptámeros seleccionados mediante un procedimiento SELEX dado, se puede agregar un paso de selección negativa o contra selección antes o inmediatamente después de la incubación objetivo. Para eliminar las secuencias con afinidad por los componentes de la matriz de inmovilización del objetivo del grupo, se puede usar la selección negativa donde la biblioteca se incuba con componentes de la matriz de inmovilización del objetivo y se retienen las secuencias sin unir. La selección negativa también se puede usar para eliminar secuencias que se unen a moléculas o células similares al objetivo incubando la biblioteca de oligonucleótidos con análogos de moléculas pequeñas, tipos celulares no deseados o proteínas no objetivo y reteniendo las secuencias no unidas.

Seguimiento de la progresión de la selecciónedItar

Para rastrear el progreso de una reacción SELEX, el número de moléculas ligadas al objetivo, que es equivalente al número de oligonucleótidos eluidos, se puede comparar con la entrada total estimada de oligonucleótidos después de la elución en cada ronda. El número de oligonucleótidos eluidos se puede estimar mediante estimaciones de concentración de elución a través de absorbancia de longitud de onda de 260 nm o etiquetado fluorescente de oligonucleótidos. A medida que la reacción SELEX se acerca a la finalización, la fracción de la biblioteca de oligonucleótidos que se une al objetivo se acerca al 100%, de modo que el número de moléculas eluidas se acerca a la estimación de entrada de oligonucleótidos total, pero puede converger en un número menor.

Advertencias y consideracioneseditar

Algunas reacciones SELEX pueden generar sondas que dependen de las regiones de unión del cebador para la formación de estructuras secundarias. Hay aplicaciones de aptámeros para las que es deseable una secuencia corta y, por lo tanto, el truncamiento de la imprimación. Un avance en el método original permite que una biblioteca de ARN omita las regiones de imprimación constantes, que pueden ser difíciles de eliminar después del proceso de selección porque estabilizan estructuras secundarias que son inestables cuando se forman solo por la región aleatoria.