Resultados

Estudiamos ratones de tipo salvaje (WT), heterocigotos V2RV31R/WT y homocigotos V2R31R/V2R31R. Los ratones mutantes tenían números y frecuencias normales de células T αβ esplénicas maduras y timocitos en cada etapa de desarrollo. Debido a la falta de marcadores congénicos, las proteínas TCRß no pueden ser identificadas por el alelo que las codifica, ni si incluyen regiones Cß1 versus Cß2. Así, se realizó citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-V2 y anti-V31 para cuantificar las células que expresaban proteínas TCRß V2+ y V31+. Analizamos los timocitos CD4+ y CD8 + positivos únicos (SP), ya que son células T αβ maduras e ingenuas. Reflejando los datos publicados (8, 9), detectamos una pequeña fracción (0,11%) de células que se tiñeron con ambos anticuerpos en ratones WT (Fig. 1 B y C), que es consistente con una pequeña población de células T αβ V2+V31+. Observamos un aumento de 12,4 veces la fracción de estas células en ratones V2R31R/WT, y un aumento de 32,8 veces en ratones V2R31R / V2R31R (Fig. 1 B y C). Estas frecuencias elevadas de células TCRß+ duales correspondían con las mayores utilizaciones de V2 y V31 en cadenas TCRß expresadas (Fig. 1 D a F). Estos datos demuestran que la mejora de la calidad RSS de dos Vß en el mismo alelo aumenta su reordenamiento y, en consecuencia, la fracción de células T que expresan dos tipos distintos de proteínas TCRß. Como el repertorio Vß de los timocitos SP refleja los niveles relativos que los segmentos Vß individuales recombinan (10), el uso preferencial de V31 sobre V2 revela que V31R supera a V2R para el reordenamiento. Esto podría deberse a una mayor accesibilidad de V31 (11) o a la interacción de V31 con segmentos Dß–Jß antes de que la contracción del locus TCRß sitúe V2 cerca de segmentos Dß–Jß. En particular, el aumento superior al doble de estas células duales TCRß+ en ratones V2R31R/V2R31R en comparación con ratones V2R31R/WT implica que dos reordenamientos distintos de V(D)Jß pueden contribuir a la expresión de TCRß del mismo alelo.

Para determinar si un solo alelo TCRß puede soportar la expresión de proteínas TCRß de dos reordenamientos V(D)Jß diferentes, analizamos ratones donde un alelo TCRß está inactivado por deleción del potenciador TCRß (Eß) (12, 13). Analizamos ratones que portaban el alelo eliminado por Eß opuesto a un alelo WT, un alelo con un reemplazo RSS de V2 (V2R) o V31 (V31R), o ambos (8). Se detectó un pequeño porcentaje (0,094%) de timocitos V2+V31+ SP en ratones WT/EβΔ (Fig. 2 A y B), que potencialmente representan una población rara de células que expresan dos proteínas TCRß diferentes del mismo alelo WT. En cualquier caso, observamos células V2+V31+ a una frecuencia 1,9 veces mayor en ratones V2R/EβΔ y a una frecuencia 4,8 veces mayor en ratones V31R/EβΔ (Fig. 2 A y B). Por lo tanto, mejorar la calidad de cualquiera de los Vß RSS eleva la fracción de células que expresan proteínas V2+ y V31+ TCRß. Notablemente, detectamos un aumento de 14,4 veces la frecuencia de células V2+V31 + en ratones V2RV31R/EβΔ en relación con ratones WT/EβΔ (Fig. 2 A y B), lo que indica que la mejora de la calidad de dos Vß RSSs aumenta sinérgicamente el porcentaje de células que expresan proteínas V2+ y V31+ TCRß. De hecho, eliminando parte del V31 RSS en el alelo V2R (el alelo V2R31Δ; Fig. 2C) reduce drásticamente la frecuencia de las células V2+V31+ a niveles equivalentes o inferiores a los de los ratones V2R/EβΔ (0,178% versus 0,135%; Fig. 2 A y B). Colectivamente, estos datos confirman que el alelo V2R31R promueve la expresión de dos proteínas TCRß distintas a partir de dos reordenamientos V(D)Jß diferentes en un solo alelo.

Nuestro estudio demuestra que un mecanismo genético intrínseco rige el ensamblaje y la expresión de TCRß monogénicos. Mostramos que los Vß RSSs de mala calidad cooperan para limitar el ensamblaje y la expresión de dos genes TCRß distintos de un alelo. Anteriormente, demostramos que el Vß RSSs de mala calidad restringe estocásticamente la frecuencia de recombinación del Vß antes de la inhibición de la retroalimentación para disminuir el ensamblaje bialélico y la expresión de los genes TCRß (8). Ahora concluimos que el Vß RSSs de baja calidad también reduce la incidencia de que tanto V31 como un Vß aguas arriba se recombinen en el mismo alelo. Estos reordenamientos podrían implicar 1) un reordenamiento V2 deletional al cúmulo Dß1–Jß1–Cß1 y un reordenamiento V31 inversionista al cúmulo Dß2–Jß2–Cß2, o 2) un reordenamiento V31 inversionista al cúmulo Dß1–Jß1–Cß1, que invierte una porción del locus que contiene el cúmulo Dß2–Jß2–Cß2, y luego un reordenamiento V2 inversionista al cúmulo Dß2–Jß2–Cß2.Cúmulo Dß2-Jß2-Cß2 (7) (Fig. 2D). Para lograr el ensamblaje y la expresión monogénicos de TCRß, este mecanismo genético basado en RSS podría funcionar con procesos epigenéticos que se han implicado para imponer la recombinación monoalélica de Vß. Por ejemplo, se ha propuesto que las interacciones dinámicas de los segmentos Vß con la lámina nuclear reducen la eficiencia de recombinación Vß al reprimir la accesibilidad a la cromatina Vß y el bucle cromosómico entre los grupos Dß–Jß y los segmentos Vß aguas arriba (14, 15). En este contexto, el Vß RSSs de mala calidad podría reducir la probabilidad de que dos reordenamientos Vß ocurran en un alelo cuando V31 y un segmento Vß aguas arriba son accesibles y el Vß aguas arriba está en bucle en proximidad con segmentos Dß–Jß. Por lo tanto, las propiedades del RSSs pueden ser la base del ensamblaje y expresión monogénicos de proteínas TCRy, TCRδ e Igλ de mamíferos y proteínas Ig en peces cartilaginosos. Además, el V RSSs puede contribuir de manera similar a la exclusión isotípica Igk e Igλ en las células B.