Un conjunto de datos de PDB no redundante

Para extraer las distribuciones estadísticas de las gráficas de glicina y pre-prolina Ramachandran, elegimos un subconjunto de alta resolución de la PDB proporcionada por el laboratorio Richardson de 500 proteínas no homólogas. Estas proteínas tienen una resolución mejor que 1,8 Å, donde todos los átomos de hidrógeno se han proyectado desde la columna vertebral y se han optimizado en términos de empaquetamiento. Siguiendo a los Richardson, solo consideramos átomos que tienen un factor B de menos de 30.

Regiones en la parcela de Ramachandran de glicina

La glicina es fundamentalmente diferente a los otros aminoácidos en que carece de una cadena lateral. En particular, la glicina no tiene el átomo Cß, lo que induce muchos choques estéricos en la trama genérica de Ramachandran. Llamamos al átomo de hidrógeno que se comparte con los otros aminoácidos, el átomo Ha1. Llamamos al átomo de hidrógeno que reemplaza al átomo Cß, el átomo Ha2. La ausencia del átomo Cß permite que la parcela de glicina Ramachandran corra sobre los bordes a -180° y 180° (Figura 1A).

El mapa de glicina observado tiene 5 regiones de densidad . Con el fin de mostrar la densidad observada en una región continua, cambiamos las coordenadas de φ-ψ a φ’-ψ’ donde φ’: 0° << 360°, y ψ’: -90° << 270°. Con la gráfica de glicina Ramachandran desplazada (Figura 3A), podemos identificar claramente las diferentes regiones. A lo largo de la franja horizontal ψ’ ~ 180°, hay tres regiones separadas. Una de ellas es una versión alargada de la región ßP de la parcela genérica de Ramachandran. La región ßP corresponde a la estructura de la poliprolina II, que forma una hélice izquierda extendida a lo largo de la cadena de proteínas . La región ßPR es un reflejo de la región ßP donde una secuencia de residuos de glicina en la conformación ßPR formará una hélice derecha. Finalmente, hay una región que corresponde a la región ßS de la parcela genérica de Ramachandran. Esta región corresponde a la conformación extendida de residuos en hojas β. Sin embargo, la región ßS de glicina, centrada en (φ’, ψ’) = (180°, 180°), está ligeramente desplazado de la región ßS de la parcela genérica de Ramachandran. También están las regiones diagonales α y aL (Figura 3A), que están asociadas con hélices y giros . A diferencia de la gráfica genérica de Ramachandran, la región α de glicina es simétrica a la región aL . En la gráfica genérica de Ramachandran, también hay una región γ correspondiente al giro γ unido al hidrógeno . La parcela de glicina Ramachandran no tiene densidad en la región γ.

Glicina parámetros. (A) La gráfica de Ramachandran en coordenadas desplazadas φ’-ψ’. Las líneas discontinuas muestran los choques estéricos que definen los límites de las densidades observadas (la Figura 2B describe las interacciones específicas). (B) Las distribuciones de varias interacciones interatómicas en función de ψ’. La línea discontinua muestra el límite de los diámetros de VDW. La línea gris da la curva del modelo calculada con la geometría ideal. En la parte inferior está la distribución de frecuencia del ángulo ψ’. C) Distribución de frecuencias de la distancia interatómica d (O···H). Hay 3 picos, de los cuales, el más pequeño en d(O···H) = 2.4 Å, que corresponde a la región ßS.

Interacciones estéricas en glicina

El mapa estérico original de glicina (Figura 2A) no explica grandes partes de la gráfica de Ramachandran de glicina observada (Figura 1A). En la observó glicina Ramachandran (Figura 3A), hay dos grandes excluidos tiras horizontales a 50° <<<< -50°, que no están excluidos en la glicina estérico mapa (Figura 2A). Por el contrario, el mapa estérico de glicina excluye una franja horizontal a -30° << 30° (Figura 2A), pero esta región está poblada en la gráfica observada (Figura 1A). También hay límites estéricos diagonales en la gráfica de glicina Ramachandran observada (Figura 1A), mientras que el mapa estérico predice límites verticales (Figura 2A).

Se realizó una reevaluación del mapa estérico de glicina (Figura 2B) siguiendo la metodología de Ho y compañeros de trabajo . Para cada interacción en la columna vertebral de glicina, consideramos la variación de la distancia interatómica con respecto a los ángulos φ’-ψ’. Comparamos la variación observada con la variación generada a partir de un modelo que utiliza geometría troncal canónica. Dividimos estas interacciones en 3 categorías: las distancias dependientes de φ, dependientes de ψ y dependientes de φ-ψ.

Para algunas de las interacciones, los resultados para la glicina son idénticos a los de la gráfica genérica de Ramachandran . Por brevedad, omitimos el análisis de estas interacciones y resumimos los resultados. La franja horizontal excluida -30 ° << 30°, debido a la interacción estérica N * * * Hi+1 en el mapa estérico de glicina (Figura 2A), no existe en la distribución observada (Figura 1A). Del mismo modo, la Oi-1···C el choque estérico en el mapa estérico de glicina original, que excluye una franja vertical centrada en φ ‘ = 0° (Figura 2A), no existe en la distribución observada (Figura 1A). Ignoramos el efecto de N * * * Hi+1 y Oi-1···C enfrentamientos estéricos. Los límites diagonales de la distribución observada están definidos por las interacciones estéricas co-dependientes φ’-ψ ‘ Oi-1···O y Oi-1···Ni + 1. En la Figura 3A, mostramos el ajuste de estas interacciones estéricas a los datos.

Aquí, analizamos la característica más distintiva de la gráfica de glicina Ramachandran: la tendencia de ψ’ a agruparse cerca de 180° y 0°. Nos centramos en las interacciones ψ ‘ – dependientes. Para cada interacción, primero calculamos la curva del modelo de la distancia interatómica correspondiente en función de ψ’ (ver Métodos). Luego comparamos la distribución ψ ‘ observada (parte inferior de la Figura 3B) con la curva. Si una repulsión de esfera dura restringe ψ’, entonces, en regiones de ψ’ donde la curva del modelo está por debajo del diámetro de van der Waals (VDW) (línea discontinua horizontal en la Figura 3B), la distribución de frecuencia ψ ‘ debería caer correspondientemente.

En la región (60° << 100°), encontramos que la caída en la distribución de frecuencia ψ (parte inferior de la Figura 3B) corresponde a valores de Ha1···Ni+1 (parte inferior de la Figura 3B) y Ha2···O (parte superior de la Figura 3B) que son más pequeños que su VDW diámetros. En la región (-90° <<<< 270°), la caída en la distribución de frecuencia ψ corresponde a las regiones donde Ha2···Ni+1 y Ha1···O se encuentran por debajo de sus radios VDW. Por el contrario, los valores de Ha1···Hi+1 y Ha2···Hi+1 nunca se encuentran significativamente por debajo de su diámetro VDW (centro de la Figura 3B).

La dependencia ψ ‘ observada en la glicina se debe a los choques estéricos Ha1···O, Ha2···O, Ha1···Ni+1 y Ha2···Ni+1. Una interpretación simple es que la dependencia de ψ en la glicina surge de conformaciones que colocan el átomo de Ni+1 u O entre los dos átomos de Ha (Figura 4A). Los límites observados en las distribuciones se han dibujado en la Figura 3A como líneas horizontales.

Palo de la figura de la representación de la glicina y la pre-prolina. (A) glicina en la conformación ψ ~ 180° donde el átomo de Ni+1 está intercalado entre los dos átomos de Ha, y (B) pre-prolina en la conformación ζ donde el átomo Oi-1 interactúa con los átomos Hδ de la prolina siguiente.

Obtenemos así un mapa estérico revisado de glicina, consistente en los choques estéricos Oi-1···O, Oi-1···Ni+1, Ha1 * * * O, Ha2···O, Ha1···Ni+1 y Ha2 * * * Ni+1. Utilizando parámetros de CHARMM22, calculamos el potencial de Lennard-Jones 12-6 debido a los choques estéricos revisados (Figura 5A). La región de energía mínima representa gran parte de la forma de la distribución observada (Figura 3A).

las interacciones dipolo-Dipolo en glicina. Los ejes se muestran en los ángulos φ’-ψ’ desplazados . Gráficas de energía de (a) los potenciales 12-6 de Lennard-Jones del conjunto revisado de choques estéricos; (b) todas las interacciones electrostáticas; (c)-(f) las interacciones dipolo-dipolo individuales de la columna vertebral de glicina (ver Figura 1A para el esquema troncal de los dipolos). Los parámetros de energía se tomaron de CHARMM22. Las áreas de luz muestran regiones de energía mínima.

Interacciones dipolo-dipolo en glicina

El mapa estérico de glicina revisado no explica la forma diagonal de las regiones α, aL, ßP, ßPR y ßS. En la gráfica genérica de Ramachandran, se encontró que la forma diagonal de las regiones se podía reproducir utilizando interacciones electrostáticas dipolo-dipolo, pero solo cuando las interacciones dipolo-dipolo se consideraban individualmente. La interacción electrostática general no reproduce la gráfica de Ramachandran observada . Aquí, utilizamos el mismo enfoque de tratar las interacciones dipolo-dipolo electrostáticas individuales a lo largo de la columna vertebral de la glicina.

Calculamos el mapa de energía de φ-ψ para las 4 interacciones dipolo-dipolo en la interacción troncal de glicina: COi-1···CO·NH * * * NHi + 1, CO * * * NH y COi-1···NHi + 1 (Figura 5C-F). Las interacciones electrostáticas se calculan con los potenciales de Lennard-Jones de los choques estéricos identificados en la sección anterior. Encontramos que se reproducen las formas de las diferentes regiones de la gráfica de glicina Ramachandran (Figura 3A) (Figura 5). La interacción CO * * * NH produce la región diagonal AL, α y ßS (Figura 5E). La interacción NH * * * NHi + 1 también produce una región diagonal AL y α (Figura 5D). La región α es simétrica a la región aL. El COi-1···La interacción de CO produce mínimos correspondientes a las regiones ßP y ßPR (Figura 5C).

En el mapa estérico de glicina original (Figura 2A), la región cercana a (φ, ψ) = (-180°, 180°) está prohibida debido a un choque estérico entre O y H. Sin embargo, la glicina tiene densidad en esta región en la parcela de Ramachandran observada (Figura 3A). Esto también se puede ver en la distribución de frecuencias de d (O···H) (Figura 3C), donde hay un pico en d (O * * * H) ~ 2,4 Å. En este pico, los átomos O y H están en contacto, ya que el diámetro VDW es de 2,5 Å. Así, en la región ßS de la glicina, la interacción favorable dipolo-dipolo CO * * * HN supera la repulsión estérica de los átomos O y H (Figura 5E).

La gráfica de Ramachandran pre-prolina

Schimmel y Flory argumentaron en 1968 que la pre-prolina – aminoácidos que preceden a la prolina – tiene una gráfica de Ramchandran particularmente restringida, en comparación con la gráfica genérica de Ramachandran . Esto fue finalmente observado en la base de datos de proteínas por MacArthur y Thornton (Figura 1B).

Hay tres diferencias principales entre la parcela de Ramachandran pre-prolina y la parcela de Ramachandran genérica. En la gráfica de Ramachandran pre-prolina, hay una gran franja horizontal excluida a -40 ° << 50°, que restringe las regiones AL y α. La región aL está desplazada hacia arriba. Estas dos características se reprodujeron en el cálculo de Schimmel-Flory y cálculos posteriores . La tercera característica es una pequeña pata de densidad que sobresale por debajo de la región β (Figura 1B; púrpura en la Figura 2C). Karplus llamó a esta región ζ , que es única de la pre-prolina.

Los cálculos anteriores no se centraron en las interacciones individuales y no tuvieron en cuenta la región ζ. Aquí, identificamos los choques estéricos exactos que determinan la trama de Ramachandran pre-prolina. A continuación analizaremos las interacciones responsables de la región ζ.

Interacciones estéricas en la columna vertebral de pre-prolina

En pre-prolina, en lugar de una interacción con el átomo NH en el aminoácido genérico siguiente, la pre-prolina interactúa con un grupo CH2 de la prolina siguiente (Figura 1B). El grupo CH2 ejerce un efecto estérico mucho mayor en la parcela de Ramachandran pre-prolina. MacArthur y Thornton sugirieron que el efecto dominante se debe a los choques estéricos N···Cδi+1 y Cß···Cδi+1. Aquí podemos analizar la eficacia de cada choque analizando directamente las distribuciones estadísticas.

Consideramos las interacciones co-dependientes φ-ψ que involucran los átomos Cδ, Hδ1 y Hδ2 de la prolina siguiente (Figura 1B). Para cada interacción, generamos la gráfica de contorno en φ-ψ de la distancia de diámetro de VDW. Al comparar la gráfica de contorno con la densidad observada en la gráfica de Ramachandran pre-prolina, identificamos las interacciones que inducen la mejor coincidencia en los límites (Figura 6A, las interacciones se identifican en la Figura 2C). Encontramos que el trozo extraído de la región β inferior izquierda de la densidad observada se debe a la Oi-1···Choque estérico Cδi+1. Otra restricción en las regiones AL y α se debe al choque estérico H···Cδi+1.

A continuación consideramos las interacciones ψ dependientes. En la distribución de frecuencia ψ pre-prolina, encontramos tres picos distintos (Figura 6B de abajo). El pico más a la izquierda a ψ ~ -50° corresponde a la región α de la pre-prolina. Nos centramos en los dos picos de la región β 50° << 180° El pico más grande centrado en ψ ~ 150° corresponde a la región ßS de la gráfica genérica de Ramachandran. En la parcela genérica de Ramachandran, esta región ßS está limitada por los enfrentamientos estéricos Cß * * * O y Cß···Ni + 1. En pre-prolina, el pico más pequeño centrado en ψ ~ 70° corresponde a la región ζ y ocurre en una región que sería excluida por el choque estérico Cß···O. En cambio, el pico más pequeño está limitado desde abajo por el choque estérico N * * * Cδi + 1. Esto se puede ver comparando la distribución ψ con la curva del modelo de N * * * Cδi + 1 vs. ψ (centro de la Figura 6B).

Pre-prolina parámetros. A) El complot de Ramachandran. Las líneas discontinuas muestran los choques estéricos que definen algunos de los límites de las densidades observadas (ver Figura 2C). (B) Las distribuciones de varias interacciones interatómicas en función de ψ. Las líneas discontinuas muestran el límite de los diámetros de VDW. La línea gris sólida da la curva del modelo calculada con la geometría ideal. En la parte inferior está la distribución de frecuencia del ángulo ψ.

Utilizando parámetros de CHARMM22, calculamos el potencial de Lennard-Jones 12-6 debido a los choques estéricos revisados (Figura 7A). Los potenciales de Lennard-Jones no pueden explicar la región ζ.

la Energía parcelas en pre-prolina como una función de la φ-ψ. Gráficos de energía de (a) los potenciales de Lennard-Jones 12-6 del conjunto revisado de choques estéricos; el COi-1···CδHδi + 1 interacciones dipolo-dipolo cuando el anillo prolina sucesivo está en (b) el fruncido HACIA ARRIBA y (c) el fruncido hacia ABAJO. Las áreas de luz muestran regiones de baja energía.

Interacciones que estabilizan la región ζ pre-prolina

Como la región ζ (púrpura en la Figura 2B) lleva la interacción Cß···O a un conflicto estérico, debe haber una interacción compensadora que estabilice la región ζ. ¿Qué es esta interacción? Para entender esta interacción, consideramos una analogía con la región γ en la gráfica genérica de Ramachandran. En la región γ, un COi distorsionado-1···Se forma un enlace de hidrógeno HNi + 1, que pone al átomo Hi+1 en contacto con el átomo Oi-1. De manera similar, en la región ζ de la pre-prolina, el átomo Oi-1 de la pre-prolina está en contacto con los átomos Hδ1 y Hδ2 (ver Figura 4B; Tabla 1), lo que sugiere que el grupo COi-1 interactúa con el grupo CδHδi+1 de la prolina siguiente.

¿Puede el grupo Cδ Hδi+1 interactuar con COi-1? Tal interacción caería dentro de la clase del enlace débil de hidrógeno CH···O, una interacción bien documentada en proteínas . Los estudios del enlace débil de hidrógeno CH···O utilizan un criterio de distancia de d (H···O) < 2,8 Å . Hay poca dependencia angular que se encuentra en el enlace CH···O alrededor del átomo H, donde a menudo se usa un criterio de ángulo de OH OHX > 90°. Esto es mucho más permisivo que la geometría del enlace canónico de hidrógeno. En la Tabla 1, enumeramos los parámetros de enlace de hidrógeno del COi-1···Interacción CδHδi + 1 en la región ζ. Como proline puede tomar dos conformaciones principales diferentes, el fruncido HACIA ARRIBA y hacia ABAJO, las mediciones de la geometría del COi-1···La interacción CδHδi + 1 también debe dividirse en términos del fruncido HACIA ARRIBA y hacia ABAJO. La geometría observada del COi-1···La geometría CδHδi + 1 satisface los criterios geométricos del enlace de hidrógeno débil (Tabla 1).

Como COi-1···El enlace de hidrógeno débil CδHδi + 1 es un contacto cercano, necesitamos modelar la interacción para comprender su dependencia de los ángulos φ-ψ. Para el modelado, consideramos las estrategias que se han utilizado para el COi análogo-1···Enlace de hidrógeno HNi + 1. El COi-1···El enlace de hidrógeno HNi + 1 ha sido modelado en estudios de mecánica cuántica donde se encontró que la región γ era la conformación de energía mínima en el vacío . Un enfoque más simple, que modeló el enlace de hidrógeno con interacciones electrostáticas dipolo-dipolo, también encuentra un mínimo en la región γ .

Aquí, modelamos el COi-1···Enlace de hidrógeno débil CδHδi + 1 como interacción electrostática dipolo-dipolo (ver Métodos). ¿Cómo modelamos el grupo CδHδi + 1 como dipolo electrostático? Bhattacharyya y Chakrabarti encontraron que, de los grupos CH en prolina, el grupo CδHδ forma la mayoría de los enlaces de hidrógeno CH···O. El átomo Cδ se encuentra junto al átomo N que retira electrones y, por lo tanto, es más ácido que los otros átomos C. En consecuencia, colocamos una pequeña carga parcial negativa en el átomo Cδ. En nuestro modelo, encontramos un mínimo de energía en la región ζ tanto para el fruncido HACIA ARRIBA (Figura 7B) como para el fruncido hacia ABAJO (Figura 7C). Concluimos que el COi-1···El enlace de hidrógeno débil Cδi+1Hδ1i + 1 estabiliza la región ζ en pre-prolina.