2.1 Respiración anaeróbica

Durante la respiración, diferentes deshidrogenasas asociadas a la membrana oxidan sustratos solubles en agua y reducen la menaquinona (MK) en la membrana a menaquinol. En condiciones aeróbicas, los electrones se utilizan para reducir el oxígeno al agua, mientras que en condiciones anaeróbicas, los electrones de crecimiento respiratorio de nitrato se transfieren al nitrato para producir nitrito (Fig. 5.1). Uno de los principales donantes de electrones de la respiración es el NADH+H+ producido en la glucólisis y el ciclo del ácido tricarboxílico. Se han descrito dos tipos de NADH deshidrogenasas unidas a membrana, NDH-I y NDH-II, para que las bacterias catalicen la oxidación de NADH+H+ a NAD+ (Yagi, 1993). NDH-I consta de 14 subunidades, codificadas por el operón nuo en Escherichia coli, y contiene mononucleótido de flavina (FMN) y varios grupos de hierro y azufre para acoplar la transferencia de electrones al bombeo de protones a través de la membrana. NDH-II consiste en una única subunidad codificada por el gen ndh. NDH-II no es una proteína de membrana integral, sino que está asociada con el lado interno de la membrana citoplasmática. Contiene dinucleótido de flavina adenina (DCP) como grupo protésico y la transferencia de electrones no está acoplada a la translocación de protones. En el genoma de B. subtilis, tres genes, yjlD, yumB y yutJ, codifican NADH deshidrogenasas potenciales del tipo NDH-II, mientras que un operón nuo está ausente del genoma de B. subtilis(Kunst et al., 1997). YjlD, rebautizado Ndh, consta de 392 residuos de aminoácidos y muestra un 29% de identidad de secuencia a NDH – II de E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Curiosamente, la cantidad de proteína Ndh de B. se encontró que subtilis se redujo significativamente en condiciones anaeróbicas (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). La Ndh parece ser la principal NADH deshidrogenasa aeróbica de B. subtilis, ya que la mutación del gen ndh exhibió un defecto de crecimiento aeróbico (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Mientras tanto, se demostró que la expresión del operón yjlC-ndh está regulada por el regulador Rex, un regulador transcripcional de detección redox, que responde a la relación NADH/NAD+ (véase también la Sección 3.3) (Gyan et al., 2006). En contraste, la expresión del gen yumB se encontró inducida bajo condiciones respiratorias de nitrato en estudios de transcriptoma (E. Härtig, resultados no publicados). Es necesario determinar si YumB y YutJ tienen actividad de NADH deshidrogenasa según lo sugerido por la similitud de secuencias de proteínas y si son relevantes en condiciones de crecimiento respiratorio de nitrato.

Al igual que otros organismos respiradores aeróbicos, B. subtilis posee una succinato deshidrogenasa (sdh) o más precisamente una succinato:quinona oxidorreductasa, SQR (Hägerhäll, 1997). El complejo enzimático es una parte integral de la membrana citoplasmática en las bacterias y de la membrana mitocondrial interna en los eucariotas. Cataliza la oxidación de succinato a fumarato acoplado a la reducción de quinona. Por lo tanto, la enzima es una parte funcional tanto del ciclo del ácido cítrico como de la cadena respiratoria (Hägerhäll, Aasa, von Wachenfeldt, Hederstedt, 1992). SQR en B. subtilis reduce MK y tiene tres subunidades de proteínas, sDHA, SdhB y SdhC. sDHA es una flavoproteína con un FAD unido covalentemente que lleva a cabo la oxidación de dos electrones del succinato a fumarato en el citoplasma. El SdhB contiene tres grupos de hierro y azufre (,, y) que funcionan en la transferencia de electrones entre el grupo flavina y el hemo b del citocromo b558 en el SdhC. SdhC tiene cinco segmentos α-helicoidales transmembrana y ancla el dímero SdhAB en el lado citoplasmático de la membrana y funciona en la transferencia de electrones transmembrana a MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoy, Aasa, & Hederstedt, 2000). Los dos cofactores del hemo b median la transferencia de electrones a través de la membrana citoplasmática hacia el lado exterior de la membrana en el que se reduce el MK y se consumen dos protones (Hederstedt, 2002). Esto es diferente de E. coli, donde los protones para la reducción de ubiquinona a ubiquinol se consumen en el lado negativo de la membrana, lo que no afecta el potencial de membrana. B. subtilis y otros bacilos, como las cepas de Bacillus megaterium y Bacillus cereus, pueden crecer en condiciones de oxígeno con succinato como fuente de carbono y energía (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium y B. cereus no crecen en condiciones anaeróbicas en presencia de glicerol. De acuerdo, faltan genes para una glicerol-3-deshidrogenasa en los genomas. Sin embargo, se detectó un gen glpD para la variante aeróbica del sistema de transferencia de electrones localizado en membrana en B. subtilis. No se encontró homología con genes que codifican otras deshidrogenasas primarias presentes en E. coli, como varias formiato deshidrogenasa, hidrogenasas, l-lactato deshidrogenasa, d-aminoácido deshidrogenasa, malato:quinona oxidorreductasas o quinoproteína deshidrogenasa de glucosa. Obviamente, B. subtilis solo posee un conjunto limitado de deshidrogenasas primarias donadoras de electrones, a saber, varias formas de NDH-II y glicerol-3-fosfato deshidrogenasa aeróbica.

En condiciones aeróbicas, los electrones pasan del menaquinol a través del complejo citocromo bc1 a la citocromo c oxidasa de tipo aa3. En condiciones microaerofílicas, se utiliza la menaquinol oxidasa de tipo citocromo bd con alta afinidad al oxígeno. El fumarato como aceptor terminal de electrones fue excluido para varios bacilos, incluyendo B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). En consecuencia, los genes para una fumarato reductasa no se encuentran en el genoma de B. subtilis. Otras cepas de Bacilos, como el Bacillus licheniformis y el Bacillus circulans, pueden respirar fumarato como E. coli.

En condiciones de crecimiento anaeróbico, B. subtilis transfiere los electrones exclusivamente a la nitrato reductasa respiratoria. En las bacterias, se clasifican tres sistemas diferentes de nitrato reductasa: las reductasas de nitrato dependientes de NAD(P)asimiladoras citoplásmicas (Nas), la reductasa de nitrato respiratorio unida a membrana (Nar) y las reductasas de nitrato disímil periplásmicas (Nap). Los tres pertenecen a la familia de proteínas DMSO reductasa y contienen el cofactor dinucleótido guanina bis-molibdopterina (MGD) (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). El genoma de B. subtilis solo codifica la nitrato reductasa respiratoria Nar. Las enzimas Nar se componen típicamente de tres subunidades. La subunidad grande NarG contiene el sitio activo con el cofactor MGD, una subunidad soluble más pequeña NarH alberga uno y tres centros, y la subunidad NarI es un citocromo b. Nar es una quinol oxidasa y el grupo de menaquinol es oxidado por la subunidad del citocromo b NarI. Dos electrones fluyen a través del hemo b de NarI a los grupos de hierro y azufre de NarH y, finalmente, a la subunidad citoplasmática NarG, que reduce el nitrato a nitrito. La proteína NarJ no es parte de la enzima, pero es necesaria para el ensamblaje final de la enzima unida a la membrana (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). Debido a los diferentes sitios para la oxidación de quinol en el periplasma y para la reducción de nitratos en el citosol, la nitrato reductasa Nar contribuye a la generación de un gradiente de protones (Fig. 5.1). El locus nar consiste en el operón narGHJI (que codifica la nitrato reductasa respiratoria), narK (para una proteína potencial de extrusión de nitritos), el marco de lectura abierto ywiC (de función desconocida), arfM que codifica el modulador de la respiración anaeróbica y la fermentación, y también el gen para el regulador anaeróbico Fnr (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

El nitrito se convierte posteriormente en amoníaco mediante la nitrito reductasa asimiladora NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). La nitrito reductasa dependiente de NADH asimiladora o productora de amonio es una enzima que contiene sirohemas que cataliza la reducción de seis electrones de nitrito a amonio. Los genes de nitrito reductasa nasDE formaban parte de un operón nasDEF y se encontraron inmediatamente aguas abajo del operón nasBC, que codifica la nitrato reductasa dependiente de NADH (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).