Morfología de la Célula Mioepitelial: Caracterización Inmunohistoquímica desde la Fase de Reposo hasta la Fase Móvil
- Resumen
- 1. Introducción
- 2. Materiales y Métodos
- 2.1. Muestras
- 2.2. Inmunohistoquímica
- 3. Resultados
- 3.1. Glándula mamaria normal
- 3.2. Tejido mamario de la Misma Línea del Tumor Mamario
- 3.3. Los resultados inmunohistoquímicos de tumores mamarios
- 4. Discusión
- Contribución de los autores
- Conflicto de intereses
- Reconocimiento
- Materiales suplementarios
Resumen
El mioepitelio está presente en tumores mamarios caninos como células suprabasales en reposo y proliferativas y células intersticiales fusiformes y estrelladas. El objetivo de este trabajo fue evaluar un panel de marcadores para la identificación de cuatro tipos morfológicos de células mioepiteliales diferentes en la glándula mamaria normal y neoplásica e investigar los cambios inmunohistoquímicos de un fenotipo epitelial a un fenotipo mesenquimal. Se utilizaron anticuerpos de citoqueratina 19 (CK19), citoqueratina 5/6 (CK5/6), citoqueratina 14 (CK14), receptor de estrógeno (ER), proteína p63, vimentina (VIM) y actina de músculo liso α (Alfa-SMA) en 29 neoplasias (3 tumores mioepiteliales benignos y 3 malignos, 7 carcinomas en tumores mixtos benignos y 16 carcinomas complejos) y en tejido normal de glándulas mamarias. Todos estos anticuerpos también se probaron en 3 tejidos mamarios de animales sin patología mamaria. Los marcadores mioepiteliales se expresaron bien en las células suprabasales y se perdieron gradualmente en los tipos móviles, con las células estrelladas manteniendo solo la expresión VIM típica del mesénquima. El ER marcó algunas células mioepiteliales móviles y en reposo. Sobre la base de nuestros resultados, proponemos una transición de células inmóviles mioepiteliales a células similares a fibroblastos migratorios. Esta transición y la caracterización de un panel inmunohistoquímico para células mioepiteliales móviles y en reposo arrojan más luz sobre el comportamiento biológico de las células mioepiteliales.
1. Introducción
Los tumores de glándulas mamarias de perros están formados por componentes epiteliales (epitelio y mioepitelio) y mesenquimales. El origen de las células mesenquimales todavía se debate. La elevada frecuencia de tumores que muestran proliferación mioepitelial o de células basales es una característica única de los tumores mamarios caninos .
En la glándula mamaria normal, la luz está delimitada por una capa interna de células epiteliales polarizadas que descansan sobre dos capas externas o basales de células epiteliales y mioepiteliales . Las células basales y mioepiteliales sintetizan la membrana basal de los conductos y alvéolos y forman una barrera estructural entre las células epiteliales luminales y el estroma circundante . En los conductos, las células mioepiteliales forman una capa casi continua de células orientadas paralelas al eje largo de los conductos. Esta capa rodea las células epiteliales luminales y las separa de la membrana basal y del estroma. En los alvéolos, las células mioepiteliales son discontinuas, formando una red en forma de cesta alrededor de los alvéolos, lo que permite que algunas células epiteliales luminales entren en contacto directamente con la membrana basal . Por lo tanto, el mioepitelio no solo está ubicado en una posición ideal para comunicarse entre estos dos compartimentos, sino que también está posicionado para proporcionar señales reguladoras importantes para el mantenimiento de la estructura celular normal .
Basado en inmunohistoquímica, las tres capas de células de la glándula mamaria normal muestran diferentes marcadores: el epitelio luminal está marcado por CK19, y las células basales y las células mioepiteliales están teñidas por CK5 / 6 y CK14 y p63, Alfa-SMA y VIM . Las células mioepiteliales son elementos contráctiles que exhiben un inmunoprofilo combinado de músculo liso y epitelial. Los marcadores mencionados anteriormente se expresan en el citoplasma, a excepción del p63, que es un marcador nuclear . La capa de células mioepiteliales es la única fuente de supresor tumoral p63, que se inhibe significativamente en la proliferación e invasión de las células tumorales asociadas . Además, las células mioepiteliales basales en la glándula mamaria normal a veces se etiquetan con anticuerpos ER, que se utilizan para la clasificación molecular de los tumores mamarios caninos .
Se pueden reconocer morfologías de células mioepiteliales distintas en tumores complejos caninos y mixtos: células mioepiteliales suprabasales en reposo y proliferativas y células mioepiteliales intersticiales móviles fusiformes y estrelladas. Las células suprabasales se encuentran entre la membrana basal y el epitelio luminal y exhiben huso aplanado (células en reposo) o morfologías poligonales (células proliferativas). Las células intersticiales se organizan con frecuencia en nidos sólidos unidos a elementos epiteliales o aislados en el intersticio . Las células mioepiteliales fusiformes y estrelladas se diferencian hacia un fenotipo contráctil más general .
Las células mioepiteliales intersticiales pueden eventualmente convertirse en células similares a fibroblastos, mostrando solo inmunorreactividad VIM . La diferenciación mioepitelial puede culminar en la formación de varios tejidos mesenquimales, incluso cartílago y hueso en el tumor mixto mamario canino.
Es probable que la adquisición de características típicas de las células mesenquimales se origine a través de la transición epitelial-mesenquimal (EMT). La EMT es un fenómeno biológico que permite que una célula epitelial polarizada, que normalmente interactúa con la membrana basal a través de su superficie basal, experimente múltiples cambios bioquímicos que le permiten asumir los rasgos y funciones de las células mesenquimales .
Este trabajo se centrará en varios aspectos de las células mioepiteliales y los tumores mamarios en perros, específicamente (1) caracterización de los cuatro tipos morfológicos de células mioepiteliales diferentes en la glándula mamaria normal y neoplásica utilizando un panel de anticuerpos y (2) los cambios inmunohistoquímicos en las células mioepiteliales de un fenotipo epitelial a un fenotipo mesenquimatoso.
2. Materiales y Métodos
2.1. Muestras
Muestras de glándula mamaria de 29 perras se recuperaron de la base de datos del Servicio Anatomopatológico de la Facultad de Veterinaria de Bolonia. Los sujetos pertenecían a razas diferentes: mestizo (𝑛=13), pastor alemán (𝑛=3), Caniche (𝑛=3), el Yorkshire Terrier (𝑛=3), el Dachshund (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Puntero (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), y Husky Siberiano (𝑛=1); todos ellos eran mujeres, con una media de edad de 9.20±2.28 años (media ± SD). Los tumores consistieron en: 3 tumores mioepiteliales benignos, 3 tumores mioepiteliales malignos, 7 carcinomas en tumores mixtos benignos y 16 carcinomas complejos (los dos últimos grupos se diferenciaron por la presencia de cartílago y/o hueso en los tumores mixtos). Además, se evaluaron 29 muestras de glándulas mamarias normales de la misma línea tumoral y 3 muestras mamarias de 3 perras sanas no mamarias con tumores.
Los tumores se clasificaron de acuerdo con Misdorp et al. y Goldschmidt et al. tumores mioepiteliales benignos: una neoplasia rara compuesta de células mioepiteliales dispuestas en haces cortos mezclados con un material basofílico fibrilar extracelular; tumores mioepiteliales malignos: diferentes de la variante benigna con células mioepiteliales más polimórficas; carcinoma complejo: carcinoma compuesto de componentes epiteliales luminales y mioepiteliales; carcinoma en tumor benigno: un tumor con focos de células epiteliales de apariencia maligna o nódulos distintos de dichas células que se presentan junto con células mesenquimales que han producido cartílago o hueso, posiblemente en combinación con tejido fibroso.
2.2. Inmunohistoquímica
Se cortaron secciones de cuatro µm de espesor de bloques incrustados en parafina fija con formalina que contenían muestras tumorales representativas. Se realizó inmunohistoquímica para los siguientes marcadores en estos tejidos: CK19, ER, CK5 / 6, CK14, VIM, Alpha-SMA, p63.
Las secciones fueron desparafinadas en tolueno y rehidratadas. La peroxidasa endógena se bloqueó por inmersión en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 20 min. Las secciones se enjuagaron con tampón Tris. La recuperación de antígenos se realizó con tampón de citrato (2,1 g de ácido cítrico monohidratado / litro de agua destilada), pH 6,0 (excepto para CK5/6 y ER, que utilizaron EDTA, pH 8,0), y calentamiento durante dos períodos de 5 minutos en un horno de microondas a 750 W, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los anticuerpos primarios se resumen en la Tabla 1. Todos los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4°C, seguidos de una técnica comercial de estreptavidina, biotina y peroxidasa (Kit LSAB, Dako, Ámsterdam, Países Bajos). Se utilizó diaminobencidina (0,05% durante 10 min a temperatura ambiente) como cromógeno. Los portaobjetos fueron contra-teñidos con hematoxilina de Papanicolaou.
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Como control negativo, el anticuerpo primario se sustituyó por un anticuerpo irrelevante, compatible con el isotipo, para controlar la unión inespecífica del anticuerpo secundario. Los controles tisulares positivos que utilizaron los mismos protocolos de IHQ incluyeron glándula mamaria normal canina (anticuerpos anti-CK19, -ER, -CK14, -VIM, Alfa-SMA, -p63) y piel canina (anti-CK5/6).
El número de células positivas por cada marcador se calculó semicuantitativamente − – = sin células teñidas, ± = menos del 5% de células positivas, + = 5-50% de células positivas, ++ = más del 50% de células positivas. Los casos se consideraron positivos para ER cuando se observó tinción nuclear en al menos 5% de las células tumorales .
3. Resultados
Se reconocieron cuatro tipos de células mioepiteliales con base en su morfología. El subtipo en reposo presentaba las características alargadas de células fusiformes en estrecho contacto con células epiteliales luminales, así como células suprabasales proliferantes que, en cambio, mostraban una forma poligonal (Figura 1(a)). Las células móviles intersticiales se observaron formando nidos (los nidos revestidos de tipo huso y las células estrelladas constituían el núcleo del nido) y aisladas en el intersticio (Figura 2(a)).
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Suprabasal las células mioepiteliales: en reposo (flechas delgadas) y proliferativa (flechas gruesas) de las células. Expresión inmunohistoquímica de un panel de anticuerpos aplicados por IHC, 63x (a) Hematoxilina-eosina; (b) anti-CK19 anticuerpos etiquetado el citoplasma; (c) anti-ER anticuerpos etiquetado de los núcleos; (d) anti-CK 5/6 anticuerpos etiquetado el citoplasma; (e) anti-CK14 anticuerpos etiquetado el citoplasma; f) anticuerpos anti-VIM que marcan el citoplasma; g) anticuerpos anti-Alfa-SMA que marcan la membrana citoplasmática; h) anticuerpos anti-p63 que marcan los núcleos.
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Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; f) anticuerpos anti-VIM que marcan el citoplasma; g) anticuerpos anti-Alfa-SMA que marcan la membrana citoplasmática; h) anticuerpos anti-p63 que marcan los núcleos.
3.1. Glándula mamaria normal
En los 3 casos de control, todas las células mioepiteliales suprabasales en reposo y proliferativas fueron marcadas por p63, CK14, Alfa-SMA y VIM. Las células mioepiteliales suprabasales en reposo y proliferativas no expresaron CK19 en ninguno de los casos.
3.2. Tejido mamario de la Misma Línea del Tumor Mamario
En los 29 tejidos normales de la misma línea que los tumores, todas las células mioepiteliales suprabasales en reposo y proliferativas se marcaron con p63, CK14, Alfa-SMA y VIM. La CK5 / 6 fue positiva en todos los casos, excepto en cuatro, y se detectó ER en 12 casos. La expresión de CK19 solo se observó en el epitelio luminal. No se observaron células intersticiales móviles mioepiteliales. Todos los resultados se resumen en la Tabla 2.
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| *−: no hay células teñidas; ±: menos de 5% de células positivas; +: 5-50% de células positivas; ++: más del 50% de células positivas. °: el fonotipo móvil no está actualizado porque no está presente. §: el fonotipo suprabasal no está actualizado porque no es detectable alrededor de las células luminales. |
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3.3. Los resultados inmunohistoquímicos de tumores mamarios
para células suprabasales (Figura 1) y móviles (Figura 2) utilizando p63, CK14, CK5/6, CK19, Alfa-SMA, VIM y RE se resumen en el cuadro 2. CK5 / 6: células suprabasales en reposo en 16 de los 29 casos (5 carcinomas en tumores mixtos benignos y 11 carcinomas complejos). CK 5/6 también etiquetó células proliferativas suprabasales y células móviles fusiformes en 10 casos (3 carcinomas en tumores mixtos benignos y 7 carcinomas complejos). Se presentaron células móviles estrelladas en 25 casos (1 tumor mioepitelial benigno, 3 tumores mioepiteliales malignos, 5 carcinomas en tumores mixtos benignos y 15 carcinomas complejos), pero fueron negativos para CK5/6. El cartílago en tumores mixtos mamarios siempre fue negativo.
CK14 mostró positividad en 23 casos en células en reposo (con la excepción de 1 carcinoma complejo y tumores mioepiteliales benignos y malignos), en 22 casos en células proliferativas (6 carcinomas en tumores mixtos benignos y 15 carcinomas complejos) con tendencia a perder la expresión cuando estas células habían adquirido el fenotipo más móvil de células fusiformes (positivo en 2 tumores mioepiteliales benignos y 3 malignos, 2 carcinomas en tumores mixtos benignos y 2 carcinomas complejos). Los condrocitos de tumores mixtos fueron negativos.
VIM fue positivo en células suprabasales en los 23 casos de carcinoma en tumores benignos y carcinomas complejos y en células mioepiteliales móviles en los 29 casos. Las células estromales fueron positivas en todos los casos. El cartílago fue VIM positivo en los 7 carcinomas de tumores mixtos benignos.Células mioepiteliales suprabasales proliferativas y en reposo marcadas con Alfa-SMA en 23 carcinomas de tumores mixtos benignos y carcinomas complejos. Las células fusiformes en 10 casos (5 carcinomas en tumores mixtos benignos y 5 carcinomas complejos) mostraron positividad para Alfa-SMA. En cada caso, a excepción de dos carcinomas complejos, las células estrelladas fueron negativas. El estroma mostró positividad en solo 6 casos (1 carcinoma en tumores mixtos benignos y 5 carcinomas complejos).
Se detectó P63 en células mioepiteliales suprabasales en reposo y proliferativas de los 23 casos de carcinoma en tumores mixtos benignos y carcinomas complejos. Todas las células móviles esféricas y estrelladas fueron negativas. Las células del estroma y el cartílago fueron negativos.
La expresión de ER estuvo presente en 11 células mioepiteliales suprabasales (4 carcinomas en tumores mixtos benignos y 7 carcinomas complejos); las células móviles fusiformes y estrelladas fueron positivas en 9 casos (3 carcinomas en tumores mixtos benignos y 6 carcinomas complejos). El cartílago de tumores mixtos fue negativo.
Las células mioepiteliales móviles fusiformes / estrelladas suprabasales en reposo y proliferativas no expresaron CK19 en ninguno de los tumores examinados. El cartílago de tumores mixtos también fue negativo para CK19.
4. Discusión
Basada en los hallazgos de Gama et al. y Tateyama et al. , cuatro tipos morfológicos de células mioepiteliales están presentes en la glándula mamaria: células mioepiteliales suprabasales en reposo y proliferativas que recubren alvéolos y conductos y células móviles intersticiales husos y estrelladas, que se encuentran en el espacio intersticial donde pueden estar dispuestas en nidos. Los marcadores mioepiteliales, como p63, CK5 / 6, CK14, Alfa-SMA y VIM, demostraron ser valiosos complementos diagnósticos para facilitar la evaluación de proliferaciones complejas y mixtas. La CK19 se considera el marcador estándar de oro para el epitelio luminal y se utilizó para evitar cualquier diagnóstico erróneo con células mioepiteliales. Debido a los patrones de reactividad cruzada y al hecho de que los focos lesionales son típicamente diminutos, ninguno de los marcadores mioepiteliales disfrutó de una sensibilidad y especificidad del 100% para las células mioepiteliales. Como tal, se deben usar al menos 2 marcadores para evaluar cualquier enfoque dado .
De acuerdo con nuestros resultados, el mejor marcador para las células suprabasales fue p63, especialmente en asociación con CK14, que se limitó a las células mioepiteliales maduras (basales) y, en menor medida, seguido por CK5 / 6, Alfa-SMA y VIM (Figura 1). Sin embargo, la CK5/6 también marcó las células epiteliales luminales, lo que dificulta distinguirlas de las células mioepiteliales suprabasales proliferativas . Morfológicamente, tanto las células epiteliales como las mioepiteliales pueden tener una forma poligonal. Una característica de CK14 y CK5/6, pero no de p63, Alfa-SMA y VIM, fue su expresión reducida en células mioepiteliales en estado proliferativo suprabasal. La expresión de CK14, CK5/6 y p63 se perdió gradualmente en las células en el estado móvil de huso y estrellado.
Alfa-SMA y VIM estaban presentes en células mioepiteliales móviles fusiformes con diferentes grados de intensidad. Solo VIM demostró ser un marcador consistente para células mioepiteliales móviles estrelladas. En este estudio, el mioepitelio móvil estrellado fue dispuesto en nidos y revestido por células en reposo presumiblemente de origen alveolar. Esta característica puede apoyar la idea de que los nidos de células mioepiteliales móviles estrelladas, que han perdido la expresión de los principales marcadores suprabasales mioepiteliales, pero conservan afinidad por VIM, son los precursores del cartílago, lo que indica que estas células han completado su transformación en elementos mesenquimales. En los tumores mioepiteliales benignos y malignos, el etiquetado VIM en todos los casos, la pérdida de todos los demás marcadores mioepiteliales suprabasales y la escasa positividad a CK14 en células fusiformes fueron indicativos de una expresión predominante del estado móvil del mioepitelio y un posible paso de células mioepiteliales simples a fibroblastos mesenquimales.
En nuestro estudio, la evidencia de que las células mioepiteliales se desplazaron a un fenotipo mesenquimatoso, demostrada por la pérdida de expresión de CK14, CK5/6 y p63, se vio reforzada por el etiquetado discontinuo de células fusiformes para Alfa-SMA, un marcador de células mioepiteliales y miofibroblastos, que se perdió completamente en células móviles estrelladas que supuestamente se convirtieron en fibroblastos.
Otros estudios de confirmación realizados por Tsuda et al. se informó de la aparición de miofibroblastos con restos de expresión de CK14 (descritos como «células mioepiteliales convertidas»). En los casos examinados en el presente estudio, la CK14 se desvaneció progresivamente, lo que indica una pérdida del fenotipo (mio)epitelial. Estos resultados apoyan la hipótesis de la EMT que involucra un estado mioepitelial similar, que sufre una transición mesenquimatosa mioepitelial (TMM). Esta hipótesis fue confirmada en el perro por Gärtner et al. la oms afirmó que en los tumores mamarios uno de los pasos en la evolución de las células mesenquimales implica la expresión de rasgos mioepiteliales típicos.
Un resultado interesante del presente estudio fue la positividad a RE encontrada en 12/29 células mioepiteliales suprabasales y 9/29 células estrelladas de carcinoma en tumores mixtos benignos y carcinomas complejos. Se han descrito dos isoformas de receptores ER, a saber, ER-α y ER-β, siendo esta última la única forma expresada en los núcleos de células mioepiteliales basales aisladas . El anticuerpo utilizado en la presente investigación incluyó ambas isoformas: se marcaron células luminales y basales/estrelladas, presumiblemente células luminales por ER-α y células basales/estrelladas por ER-β.
En conclusión, las células mioepiteliales suprabasales se caracterizaron bien por p63 y CK14 y en menor medida por el otro marcador utilizado. En cambio, las células mioepiteliales móviles se caracterizan por Alfa-SMA y VIM y pérdida de CK14, CK5 / 6 y p63 (Figura 2). El presente estudio también demostró la RE en células epiteliales luminales y mioepiteliales suprabasales/estrelladas (estas últimas en aproximadamente la mitad de los casos) y que la expresión de la RE no está influenciada por la fase de reposo/movilidad. Por lo tanto, en las secciones seriadas o de varias tintas, la inmunohistoquímica a la sala de emergencias en combinación con p63 y CK14 puede servir para evitar la identificación errónea de células luminales o mioepiteliales en tumores mamarios caninos. La tendencia de la expresión conservada de Alfa-SMA y VIM en células fusiformes, y solo la positividad de VIM en células móviles estrelladas, así como la disminución de la expresión de p63 en ambos tipos móviles, apoyan la hipótesis de la EMT que involucra un estado mioepitelial en la TMM. La célula móvil fusiforme podría considerarse una transformación más temprana que la célula estrellada hacia un fenotipo mesenquimatoso.
Contribución de los autores
Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Reconocimiento
Los autores agradecen a la Sra. Anne Collins por editar el texto en inglés.
Materiales suplementarios
Tabla suplementaria 1: Resultados inmunohistoquímicos.
Tabla Suplementaria 2: Edad, Raza y Hallazgos Clínicos.
- Material suplementario