Las bacterias gram negativas, al igual que los orgánulos energéticos de plantas y animales (el cloroplasto y las mitocondrias), tienen dos bicapas de membrana denominadas membranas externa e interna. El espacio entre estas dos membranas se denomina periplasma. Mucho antes de los eucariotas unicelulares, el periplasma evolucionó como el primer compartimento extracitoplasmático para proporcionar una importante adaptación competitiva a las bacterias gramnegativas. El conocimiento temprano y el descubrimiento del periplasma se desarrollaron incluso antes de su visualización morfológica. En la década de 1960, los científicos estaban tratando de entender cómo las enzimas tóxicas involucradas en la degradación de moléculas biológicas importantes, como ribonucleasas y fosfatasas producidas por la bacteria gramnegativa Escherichia coli, no eran tóxicas para la célula. Los métodos de extracción bioquímica sugirieron un compartimiento separado, porque tal extracción preservó el citoplasma unido a la membrana interna, y estos esferoplastos podrían crecer nuevamente y sintetizar más enzimas . El desarrollo de la microscopía electrónica llevó a la visualización de las dos bicapas de membrana separadas por el periplasma .

La membrana adicional permite la creación del periplasma como un compartimento celular separado cuyas nuevas funciones probablemente proporcionaron una ventaja selectiva significativa y quizás incluso más importante que la exclusión de toxinas (Tabla 1). Estas funciones novedosas incluyen el transporte de proteínas, el plegamiento, la oxidación y el control de calidad similares al retículo endoplásmico de las células eucariotas. El periplasma también permite el secuestro de enzimas que pueden ser tóxicas en el citoplasma, funciones de señalización importantes y regulación de la división celular. Además, contribuye a la capacidad de la célula para soportar la presión de turgencia al proporcionar sistemas estructurales que funcionan en concierto con la membrana externa, como peptidoglicanos y lipoproteínas, sistemas de flujo de múltiples fármacos y solutos específicos que contribuyen a un Donnan o potencial iónico a través de la membrana externa. El periplasma también contiene las plataformas de ensamblaje involucradas en la secreción de proteínas de barril beta de estructura única, lipoproteínas y glicerolfosfolípidos a la membrana externa (Fig.1).

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Fig 1. Arquitectura de la envoltura de células bacterianas gramnegativas.

Se muestra la bicapa asimétrica de lipopolisacáridos y glicerolfosfolípidos que componen la membrana externa. La membrana interna es una bicapa simétrica de glicerolfosfolípidos. El espacio periplásmico es la región entre estas membranas que incluye una variedad de enzimas y funciones, incluida la oxidación y el control de calidad de las proteínas. También dentro del espacio periplásmico hay una capa de azúcares reticulados y aminoácidos denominada peptidoglicano, que rodea la célula. El peptidoglicano está unido a la membrana externa en bacterias entéricas a través de enlaces de transpeptidasa covalente entre una abundante lipoproteína de la membrana externa Lpp. Una variedad de sensores se ubican en la membrana interna con dominios periplásmicos que detectan el cambio ambiental y, en el caso del sistema Rcs, un cambio en la ubicación de la lipoproteína de la membrana externa RcsF. Complejos de proteínas multicomponentes, como la máquina flagelar, abarcan las dos membranas. IM, membrana interna; Lpp, lipoproteína de Braun; LPS, lipopolisacárido; RcsF, Regulador de síntesis de cápsulas F.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935.g001

La membrana externa es un orgánulo único conectado a otras partes de la envoltura celular a través del periplasma. Las bacterias grampositivas carecen de una membrana externa, pero tienen un polímero peptidoglicano más extenso que protege su superficie. A diferencia de la membrana interna bacteriana, que es una bicapa de glicerolfosfolípidos similar a la de la mayoría de las membranas de mamíferos y que tiene un flujo específico caracterizado por la difusión lateral, la membrana externa tiene un flujo restringido . Es una bicapa única, con el prospecto interno que tiene un contenido típico de glicerolfosfolípidos de fosfotidiletanolamina, fosfatidilglicerol y cardiolipina, y el prospecto externo compuesto en gran parte de un glicolípido único, lipopolisacárido (LPS) . Los fosfatos de LPS confieren una carga negativa a la superficie, y se crea un potencial de Donnan específico a través de la membrana externa en el periplasma . La membrana externa funciona como una barrera selectiva que permite el transporte de nutrientes valiosos a la vez que proporciona una barrera contra compuestos tóxicos, como los compuestos antimicrobianos catiónicos producidos por todos los organismos, incluidas muchas bacterias grampositivas . Otro componente de esta barrera son las proteínas de la membrana externa con una estructura de barril beta única que se insertan en la membrana externa a través de un sistema periplásmico específico de chaperón . Estas proteínas se ensamblan en la membrana externa como puntos específicos, lo que indica que la membrana externa probablemente se ensambla en parches discretos específicos que contienen proteínas y la bicapa lipídica asimétrica única . Entre estas proteínas de membrana externa se encuentran las porinas, que pueden actuar como canales selectivos que permiten la entrada de sustratos hidrófilos de un tamaño específico al periplasma. Afortunadamente para los seres humanos, estas porinas transportan antibióticos betalactámicos hidrófilos, lo que permite su penetración en el periplasma, donde se dirigen a la síntesis del importante elemento estructural de la pared celular: el peptidoglicano polimérico. La membrana externa de algunas bacterias está anclada al polímero de peptidoglicanos a través de abundantes lipoproteínas, que se insertan en la valva interna de la membrana externa a través de sistemas de secreción específicos . Una variedad de complejos proteicos importantes funcionan como nanomáquinas y utilizan hidrólisis de ATP para secretar macromoléculas o convertir un orgánulo de motilidad llamado flagelos . Por lo tanto, la membrana externa y la membrana interna también están conectadas a través del periplasma por complejos proteicos que abarcan la membrana. Por lo tanto, la membrana externa se compone de parches claramente ensamblados que comprenden un orgánulo complejo que se puede unir a la capa de peptidoglicano y la membrana interna a través de enlaces de proteínas covalentes y no covalentes. El ensamblaje de la membrana externa y su enlace con el peptidoglicano y el citoplasma crea un espacio entre la membrana interna y la membrana externa, que es el periplasma.

A pesar de las importantes funciones contenidas dentro del espacio periplasmático, durante muchos años ha habido debate sobre la distancia o el tamaño de la intermembrana de este compartimento y si hay uniformidad de espaciamiento entre las membranas internas y externas en toda la célula. Existía la preocupación de que muchas de las visualizaciones de este espacio como de un tamaño específico eran artefactos de fijación para imágenes por microscopía electrónica y que, de hecho, el espacio era en realidad solo un espacio potencial. Los primeros estudios microscópicos electrónicos de Bayer demostraron adherencias entre la membrana externa e interna que borraban parte de estos espacios; sugirió que los puntos de adhesión eran áreas donde el lípido principal de la lámina externa, LPS, se entregaba a la membrana externa desde su sitio de síntesis en la membrana interna . Sin embargo, su trabajo fue posteriormente desacreditado como derivado de la observación de artefactos de fijación potenciales, aunque muchos expertos hoy en día piensan que puede haber adherencias reales a base de proteínas entre las membranas porque algunos sistemas de eflujo y transporte no contienen componentes de dimensiones suficientes para abarcar el espacio visualizado. La presencia de áreas específicas en las que las membranas están muy juntas explicaría cómo podrían funcionar algunas de estas bombas de transporte y flujo de casete de unión a ATP (ABC) ; estos sistemas tienen componentes proteicos periplásmicos que son esenciales para el transporte de eflujo, LPS u otros glicolípidos, pero carecen de un tamaño intrínseco o de naturaleza polimérica lo suficientemente grande como para alcanzar la membrana externa y, por lo tanto, proporcionar un mecanismo para promover el transporte. Además, el periplasma contiene muchos otros componentes que requieren al menos un cierto volumen para el espacio periplásmico, principalmente la capa polimérica de peptidoglicano que rodea la célula. En la actualidad, no está claro cómo estos transportadores se mueven alrededor de este polímero y el ancho del periplasma para entrar en contacto con la membrana, aunque un trabajo reciente que demuestra que las lipoproteínas de la membrana externa pueden coordinar la síntesis de peptidoglicanos a través del contacto directo indica que al menos algunas proteínas pueden caber a través de los poros del peptidoglicano para lograr funciones importantes

En contraste, una variedad de orgánulos, incluido el flagelo y el complejo de agujas del sistema de secreción Tipo III asociado a virulencia, requieren el ensamblaje de polímeros dentro del periplasma que abarcan las dos membranas. En el caso del flagelo, su varilla o eje de transmisión se extiende por el periplasma, y su longitud está determinada por el polímero que entra en contacto con la membrana externa. Un elegante trabajo reciente del grupo de Kelly Hughes ha demostrado que el tamaño del periplasma, o la distancia entre las dos membranas, está controlado en gran medida en bacterias entéricas por una lipoproteína específica llamada lipoproteína de Braun (o Lpp), que une covalentemente la membrana externa a la capa de peptidoglicano . Esto es bastante notable porque la Lpp es la proteína más abundante presente en las bacterias entéricas, descrita por Braun hace 48 años, y hasta este punto no se le había atribuido ninguna función específica. Esta proteína alfa-helicoidal se inserta a través de su anclaje lipídico en la valva interna de la membrana externa y se une covalentemente al polímero peptidoglicano por una familia de transpeptidasas . Alargar estas lipoproteínas que permiten la expansión del periplasma conduce a una varilla flagelar más larga y un comportamiento de natación más eficiente. Estos autores interpretaron este resultado como una indicación de que deben existir otras funciones seleccionadas evolutivamente que limiten el tamaño periplásmico, forzando una reducción en la eficiencia de la natación. En este número de PLOS Biology, se revela una de esas funciones importantes: una función de señalización del daño de la envoltura controlada por otra lipoproteína de la membrana externa, Regulador de la síntesis de cápsulas F (RcsF), que detecta el trastorno o daño de la envoltura.

Las bacterias gramnegativas tienen una variedad de funciones importantes que detectan el daño de la membrana y los compuestos tóxicos, como los péptidos antimicrobianos, que dañan la membrana externa . Estos sistemas de detección incluyen aquellos que permiten remodelar la superficie bacteriana para que sea más resistente a los compuestos tóxicos, de forma análoga a las naves espaciales que energizan sus escudos en las historias de ciencia ficción . Algunos de estos sistemas de detección son receptores que funcionan como cinasas de sensores con dominios en el periplasma para detectar moléculas específicas o daños. Sin embargo, uno de los sistemas de cinasas de sensores más únicos, denominado sistema Rcs, que en el daño de la membrana activa la síntesis de polisacáridos extracelulares para proporcionar protección celular y formación de biopelículas, tiene una lipoproteína de membrana externa RcsF, que interactúa con proteínas de señalización con dominios periplásmicos específicos en el daño de la envoltura y el estrés de peptidoglicanos para activar la síntesis de la producción de polisacáridos extracelulares y otras vías de afrontamiento relacionadas con el estrés . Por lo tanto, el daño de la envoltura de alguna manera lleva a la lipoproteína RcsF a una mayor proximidad al sistema de detección de membrana interna, y por lo tanto evolucionó a un trastorno de detección en la membrana externa y/o peptidoglicano (Fig.2). En este número de PLOS Biology, los autores demuestran de manera concluyente que esta detección requiere que el periplasma sea de un tamaño específico porque las mutaciones que alargan el anclaje de lipoproteína Lpp altamente abundante desde la membrana externa hasta el peptidoglicano (lo que resulta en un aumento del tamaño del periplasma) abolieron la señalización a menos que la lipoproteína sensible (que en el daño de la membrana debe alcanzar el sensor de membrana interna) también se alarga . Este trabajo también muestra claramente un orden y tamaño muy específicos para el periplasma; el tamaño del periplasma se ve claramente, ya que existe en asociación con los cambios en el anclaje de las lipoproteínas o la longitud por microscopía crioelectrónica. Esta tecnología y la tomografía electrónica utilizada en el trabajo del grupo Hughes en relación con el rotor flagelar están revolucionando nuestra visión de la envoltura celular bacteriana y los complejos de proteínas que abarcan el periplasma para realizar funciones importantes .

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Fig 2. La señalización de RcsF se altera por un cambio en el tamaño del espacio periplasmático.

El sensor de lipoproteínas de membrana externa RcsF debe ponerse en contacto con sus socios de señalización de membrana interna para activar la detección. Esta detección requiere una distancia periplásmica específica porque el alargamiento de los enlaces de Lpp a peptidoglicano aumenta la distancia del periplasma, y a menos que RcsF se alarga, la señalización ya no puede ocurrir. En el panel A: el estado en el que RcsF no está activando la señalización porque no hay trastorno de envoltura en curso. En el grupo B: el trastorno de la envoltura conduce a interacciones físicas RcsF con el sistema de detección de membrana interna, y el regulador Rcs se activa. En el panel C, en el que el Ppl se ha alargado y la distancia periplasmática intermembrana se ha alargado, el Rcs regulon no se puede activar a pesar del trastorno de la envoltura. En el panel D: el defecto del Lpp largo se corrige alargando el RcsF. IM: membrana interna; Lpp: lipoproteína de Braun; OM: membrana externa; PG: peptidoglicano; RcsF: Regulador de la síntesis de cápsulas F.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935.g002

Aunque estos estudios recientes han definido Lpp como una regla molecular específica entre la membrana externa y el peptidoglicano, se desconoce qué regula la distancia entre la membrana interna y el peptidoglicano y qué controla la polimerización o degradación del polímero de peptidoglicano para que no obstruya completamente las proteínas que abarcan el periplasma. Definir estos y otros misterios de la envoltura celular podría conducir a importantes avances prácticos, además de satisfacer nuestro impulso científico para resolver los misterios de la envoltura celular bacteriana gramnegativa. Esta envoltura es un tamiz molecular notablemente eficiente y evolutivamente avanzado que hace que el desarrollo de antibióticos contra estos organismos sea mucho más difícil que para las bacterias grampositivas, que carecen de la membrana adicional y el periplasma.

Un mayor conocimiento de la envoltura celular gramnegativa también es fundamental para comprender los mecanismos de resistencia a los antibióticos, ya que muchos de nuestros antibióticos más exitosos, incluidos los antibióticos betalactámicos (que se dirigen al peptidoglicano y entran a través de las porinas), se dirigen a la envoltura celular. Las bacterias gramnegativas y los organismos multirresistentes continúan evolucionando a través de mutaciones en la envoltura y la adquisición de nuevas enzimas periplásmicas. Hay una falta de nuevos antibióticos para las bacterias gramnegativas en la tubería debido a la dificultad de romper la barrera única proporcionada por la membrana externa y el periplasma. En este sentido, los antibióticos con dianas periplásmicas tienen una ventaja sobre aquellos que se enfrentan a las dificultades de penetrar la membrana interna y evitar efluentes significativos. Es interesante especular que el objetivo de las funciones periplásmicas esenciales que requieren un periplasma de tamaño específico y capacidad para acomodar diferentes funciones podría ofrecer nuevos objetivos importantes para el desarrollo de antibióticos. Estudios recientes han descubierto nuevas funciones básicas de la envoltura gramnegativa a través de genética bacteriana, biología estructural y técnicas morfológicas avanzadas. A pesar de décadas de estudio, queda mucho por aprender sobre la envoltura celular bacteriana gramnegativa. El descubrimiento de otros misterios en esta área debería llevar a una nueva generación de objetivos para el desarrollo de antibióticos que nos mantengan un paso por delante en la carrera armamentista con bacterias gram negativas resistentes a los antibióticos.