Activación de RNasa H

La RNasa H es una enzima ubicua que degrada la cadena de ARN de un dúplex ARN–ADN. Se ha identificado en organismos tan diversos como virus y células humanas (Crouch y Dirksen, 1985). Se han identificado al menos dos clases de RNasa H en células eucariotas. Se han observado múltiples enzimas con actividad de la RNasa H en procariotas (Crouch y Dirksen, 1985). Aunque la RNasa H está involucrada en la replicación del ADN, puede desempeñar otras funciones en la célula y se encuentra en el citoplasma, así como en el núcleo (Crum et al., 1988). Sin embargo, se cree que la concentración de la enzima en el núcleo es mayor y que parte de la enzima que se encuentra en las preparaciones citoplasmáticas puede deberse a fugas nucleares.

No se conocen los elementos de reconocimiento precisos de la RNasa H. Sin embargo, se ha demostrado que los oligonucleótidos con propiedades similares al ADN, tan cortos como los tetrámeros, pueden activar la RNasa H (Donis-Keller, 1979). Los cambios en la influencia del azúcar en la activación de la RNasa H como modificaciones del azúcar que dan lugar a oligonucleótidos similares al ARN, por ejemplo, 2 ‘- fluoro o 2 ‘ – metoxi, no parecen servir como sustratos para la RNasa H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). Las alteraciones en la orientación del azúcar a la base también pueden afectar la activación de la RNasa H, ya que los oligonucleótidos α no pueden inducir la RNasa H o pueden requerir recocido paralelo (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Además, las modificaciones de la columna vertebral influyen en la capacidad de los oligonucleótidos para activar la RNasa H. Los metilfosfonatos no activan la RNasa H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). En contraste, los fosforotioatos son sustratos excelentes (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein y Cheng, 1993). Además, se han estudiado moléculas quiméricas como oligonucleótidos que se unen al ARN y activan la RNasa H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Por ejemplo, los oligonucleótidos compuestos de alas de 2 ‘ – metoxi fosfonatos y un hueco de cinco bases de desoxioligonucleótidos se unen a su ARN diana y activan la RNasa H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Además, se demostró que un solo ribonucleótido en una secuencia de desoxirribonucleótidos era suficiente para servir como sustrato de la RNasa H cuando se unía a su desoxi-oligonucleótido complementario (Eder y Walder, 1991).

También se ha demostrado que es posible aprovechar los oligonucleótidos quiméricos diseñados para activar la RNasa H y tener mayor afinidad por sus receptores de ARN y para mejorar la especificidad (Giles y Tidd, 1992; Monia et al., 1993). En un estudio, la escisión del transcripción diana mediada por la RNasa H fue mucho más selectiva cuando se compararon los desoxioligonucleótidos compuestos de alas de desoxioligonucleótidos de metilfosfonato y huecos de fosfodiéster con oligonucleótidos de fosfodiéster completos (Giles y Tidd, 1992).

A pesar de la información sobre la RNasa H y la demostración de que muchos oligonucleótidos pueden activar la RNasa H en ensayos de enzimas lisadas y purificadas, todavía se sabe relativamente poco sobre el papel de las características estructurales en los blancos de ARN en la activación de la RNasa H (Minshull y Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder y Walder, 1988). De hecho, la prueba directa de que la activación de la RNasa H es, de hecho, el mecanismo de acción de los oligonucleótidos en las células ha faltado, hasta hace muy poco tiempo.

Los estudios recientes en nuestros laboratorios proporcionan información adicional, aunque indirecta, sobre estas cuestiones. ISIS 1939 es un fosforotioato de 20 mer complementario a una secuencia en la región 3’no traducida del ARN ICAM-1 (Chiang et al., 1991). Inhibe la producción de ICAM en células endoteliales de venas umbilicales humanas y los blots septentrionales demuestran que ICAM-1 mRNA se degrada rápidamente. Un análogo 2 ‘ – metoxi de ISIS 1939 muestra una afinidad más alta por el ARN que el fosforotioato, es estable en las células, pero inhibe la producción de proteína ICAM-1 con mucha menos potencia que ISIS 1939. Es probable que ISIS 1939 desestabilice el ARN y active la RNasa H. En contraste, ISIS 1570, un fosforotioato de 18 mer que es complementario al codón de iniciación de traducción del mensaje ICAM-1 inhibió la producción de la proteína, pero no causó degradación del ARN. Por lo tanto, dos oligonucleótidos que son capaces de activar la RNasa H tuvieron diferentes efectos dependiendo del sitio en el ARNm al que se unían (Chiang et al., 1991). Una demostración más directa de que la RNasa H es probablemente un factor clave en la actividad de muchos oligonucleótidos antisentidos fue proporcionada por estudios en los que se utilizó PCR de ligadura inversa para identificar productos de escisión a partir de ARNm crab en células tratadas con oligonucleótidos de fosforotioato (Crooke et al., 1995).

Dado el papel emergente de los oligonucleótidos quiméricos con modificaciones en las alas 3′ y 5’diseñadas para mejorar la afinidad por el ARN objetivo y la estabilidad de la nucleasa, y un espacio tipo ADN para servir como sustrato de la RNasa H, los estudios enfocados en comprender los efectos de varias modificaciones en la eficiencia de la enzima(s) también son de considerable importancia. En uno de estos estudios sobre la E. coli RNasa H, hemos reportado que la enzima muestra una especificidad de secuencia mínima y es procesiva. Cuando un oligonucleótido quimérico con azúcares modificados 2′ en las alas se hibridó con el ARN, el sitio inicial de escisión fue el nucleótido adyacente a la unión metoxi – desoxi más cercana al extremo 3’del sustrato de ARN. La tasa inicial de escisión aumentó a medida que aumentaba el tamaño de la brecha de ADN y la eficiencia de la enzima era considerablemente menor contra un objetivo de ARN duplicado con un oligonucleótido antisentido quimérico que un oligonucleótido de tipo ADN completo (Crooke et al., 1995).

En estudios posteriores, hemos evaluado las interacciones de oligonucleótidos antisentidos con dianas estructuradas y no estructuradas, y los impactos de estas interacciones en la RNasa H con más detalle (Lima y Crooke, 1997). Utilizando una serie de sustratos no disociables y análisis de Michaelis-Menten, pudimos evaluar tanto la unión como la escisión. Demostramos que, de hecho, la E. coli RNasa H1 es una proteína de unión de ARN de doble cadena. El Kd para el dúplex de ARN fue de 1,6 µM; el Kd para un dúplex de ADN fue de 176 µM; y el Kd para el ADN de una sola hebra fue de 942 µM. En contraste, la enzima solo podía escindir el ARN en un dúplex ARN-ADN. Cualquier modificación de 2’en el medicamento antisentido en el sitio de la escisión inhibió la escisión, pero se toleraron reducciones significativas de la carga y modificaciones de 2’en el sitio de unión. Finalmente, la colocación de una carga positiva (por ejemplo, 2 ‘ – propoxiamina) en el medicamento antisentido redujo la afinidad y el escote. También hemos examinado los efectos de las estructuras de ARN inducidas por oligonucleótidos antisentidos sobre la actividad de la E. coli RNasa H1 (Lima y Crooke, 1997). Se encontró que cualquier estructura en el sustrato dúplex tenía un efecto negativo significativo en la tasa de escisión. Además, la escisión de sitios seleccionados se inhibió por completo, y esto se explicó por un obstáculo estérico impuesto por el bucle de ARN que atraviesa los surcos menores o mayores o el heteroduplex. Recientemente hemos clonado y expresado la RNasa humana H1. La proteína es homóloga a la RNasa H1 de E. coli, pero tiene propiedades similares a las descritas para la RNasa H humana tipo 2 (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). La enzima es estimulada por bajas concentraciones de Mg2+, inhibida por concentraciones más altas, y es inhibida por Mn2+ en presencia de Mg2+. Tiene un peso molecular de 33 kDa. Es una proteína de unión de ARN de doble hebra y exhibe preferencias únicas de posición y secuencia para la escisión(Wu et al., 1999). Además, se ha clonado la RNasa H2 humana, pero hasta la fecha no se ha demostrado que la proteína expresada sea activa (Frank et al., 1998). Muy recientemente, hemos informado sobre los efectos de varias mutaciones introducidas en la RNasa H1 humana en la actividad de la enzima (Wu et al., 2000). Por lo tanto, ahora tenemos las herramientas necesarias para comenzar a explorar el papel de la RNasa H humana en los procesos biológicos y farmacológicos y comenzar a desarrollar fármacos diseñados para interactuar con ellos de manera más efectiva.

Finalmente, al menos con respecto a la degradación inducida por la RNasa H del ARN dirigido, recientemente hemos demostrado que en el rango de 1-150 copias de ARN por célula, el nivel de ARN objetivo no tiene efecto sobre la potencia de los inhibidores antisentidos (Miraglia, 2000). Esto se debe al hecho de que el número de moléculas de fármaco antisentido por célula excede el número de copias de ARN en varios órdenes de magnitud. Por lo tanto, otros factores deben ser la limitación de la tasa.