Lott fue seleccionado en la primera ronda (8ª general) del Draft de la NFL de 1981 por los San Francisco 49ers. El nivel de habilidad demostrado por el destacado de 6 pies y 203 libras fue reconocido instantáneamente, y desde el comienzo del campamento de entrenamiento tuvo el trabajo de lateral izquierdo inicial de los 49ers. En su temporada de novato en 1981, registró siete intercepciones, ayudó a los 49ers a ganar el Super Bowl XVI, y también se convirtió en el segundo novato en la historia de la NFL en devolver tres intercepciones para touchdowns. Su excelente juego resultó en su segundo puesto en el rookie of the year, detrás del apoyador de los New York Giants Lawrence Taylor.

Lott pasó a la posición de seguridad en 1985. Le amputaron la punta de su dedo meñique izquierdo después de la temporada de 1985, cuando fue aplastado mientras se enfrentaba al corredor Timmy Newsome, y una cirugía de injerto óseo no le habría permitido comenzar la temporada de 1986. Una lesión lo dejó de lado para los dos últimos partidos de la temporada en 1986, pero aún así lideró la liga con las 10 mejores intercepciones de su carrera, mientras registraba 77 tacleadas, tres balones sueltos forzados y dos capturas de mariscal de campo. En sus 10 años con los 49ers, Lott les ayudó a ganar ocho títulos de división y cuatro Super Bowls: XVI (temporada de 1981), XIX (1984), XXIII (1988) y XXIV (1989). Es uno de los cinco jugadores que participaron en las cuatro victorias del Super Bowl de los 49ers de la década de 1980. Los otros cuatro son el mariscal de campo Joe Montana, el apoyador Keena Turner, el cornerback Eric Wright y el receptor Mike Wilson.

Después de su carrera con San Francisco, Lott firmó como agente libre en 1991 con Los Angeles Raiders, y en 1993 con los New York Jets. En 1991, lideró la liga en intercepciones (8) por segunda vez. Lott firmó un contrato de agente libre con los Kansas City Chiefs en 1995, pero se lesionó en la pretemporada. Regresó a los 49ers en 1995, pero las lesiones que había sufrido en las cuatro temporadas anteriores continuaron atormentándolo, y anunció su retiro antes de que comenzara la temporada. Fue elegido para el Salón de la Fama del Fútbol Profesional en 2000, su primer año de elegibilidad, y también fue nombrado para el Equipo del 75 Aniversario de la NFL en 1994 y el Equipo del 100 Aniversario en 2019.

En sus 14 temporadas en la NFL, Lott registró 8.5 capturas y 63 intercepciones, que regresó para 730 yardas y cinco touchdowns. Recuperó 17 balones sueltos, los devolvió para 43 yardas, y ganó 113 yardas en los regresos de saque inicial. Lott también jugó en 20 partidos de postemporada, registrando nueve intercepciones, 89 tackleadas, un balón suelto forzado, una recuperación de balón suelto y dos touchdowns. Además, fue nombrado All-Pro ocho veces, All-NFC seis veces y All-AFC una vez. Más allá de las estadísticas, Lott tenía una conciencia asombrosa de cómo se estaba desarrollando una jugada, lo que le permitió romper pases y ganar una reputación como uno de los tacklers de campo abierto más duros y eficientes en la historia de la liga.