Préparation de la matrice extracellulaire et rhéologie

L’ECM est composé d’un réseau de gélatine et de fibrine. Pour préparer les composants ECM, une solution de gélatine à 15% en poids / v (Type A, 300 fleurs de peau porcine, Sigma) est d’abord produite en ajoutant de la poudre de gélatine à une solution chaude (70 ° C) de DPBS (1X solution saline tamponnée au phosphate de Dulbelco sans calcium ni magnésium). On laisse dissoudre complètement la gélatine sous agitation pendant 12 h à 70 °C, puis on ajuste le pH à 7,5 à l’aide de NaOH 1 M. La solution est filtrée stérile et stockée à 4 °C en aliquotes pour une utilisation ultérieure en coulée (< 3 mois). Une solution de fibrinogène (50 mg/mL) est produite par dissolution de la protéine plasmatique sanguine bovine lyophilisée (Millipore) à 37 °C dans des DPB stériles sans calcium ni magnésium. La solution est maintenue à 37 °C sans agitation pendant au moins 45 min pour permettre une dissolution complète. La solution de transglutaminase (TG) (60 mg/mL) est préparée en dissolvant de la poudre lyophilisée (Moo Gloo) dans des DPBS sans calcium ni magnésium et en mélangeant doucement pendant 20 sec. La solution est ensuite maintenue à 37 °C pendant 20 min et filtrée stérile avant utilisation. Une solution mère de CaCl2 (250 mM) est préparée par dissolution de la poudre de CaCl2 dans des DPB sans calcium ni magnésium (Corning). Pour préparer une solution mère de thrombine, la thrombine lyophilisée (Sigma Aldrich) est reconstituée à 500 U/mL à l’aide de DPB stériles et conservée à -20 °C. Les aliquotes de thrombine sont décongelées immédiatement avant l’utilisation.

Un rhéomètre à contrainte contrôlée (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) avec un diamètre de 40 mm, une géométrie de cône et de plaque de 2 ° est utilisé pour les mesures de rhéologie de l’encre. Les modules de stockage en cisaillement (G’) et de perte (G ») sont mesurés à une fréquence de 1 Hz et une déformation oscillatoire (γ) de 0,01. Les balayages temporels sont effectués en plaçant rapidement une solution d’ECM prémélangée contenant de la thrombine sur la plaque Peltier maintenue à 37 °C.

Formulations d’encre

Deux encres sont nécessaires pour la bio-impression 3D de modèles PT perfusables. Une encre, qui est utilisée pour créer le joint de puce de perfusion, est composée d’un élastomère de silicone en deux parties (SE 1700, DOW Chemical) avec une base de catalyseur 10: 1 (en poids) qui est homogénéisé à l’aide d’un mélangeur centrifuge pendant 2 min (2000 tr / min, AE-310, Thinky Corp, Japon). L’encre silicone est imprimée dans les 2 h suivant le mélange avec le catalyseur. Cette encre est chargée dans une seringue (EFD Inc., East Providence, RI) et centrifugé pour éliminer les bulles d’air avant l’impression à température ambiante. L’autre encre, une encre fugitive utilisée pour imprimer le tubule, est composée de 38% en poids de F127 pluronique (Sigma) et de 100 U/mL de thrombine dans de l’eau déionisée ultrafiltrée (DIUF). L’encre fugitive est teinte en rose grâce à l’ajout d’un colorant pour réacteur à risque pour visualisation sur la Fig. 1 et Film S1. Pour préparer cette encre, une solution de F127 Pluronique à 40% en poids dans l’eau est homogénéisée à l’aide d’un mélangeur Thinky jusqu’à dissolution complète de la poudre, puis stockée à 4 ° C. Avant utilisation, une solution de thrombine à 2000 U / mL est ajoutée à l’encre fugitive (Pluronique) dans un rapport de 1:20, et homogénéisée à l’aide d’un mélangeur Thinky. L’encre fugitive est ensuite chargée dans une seringue (EFD Inc., East Providence, RI) à 4 °C et centrifugé pour éliminer les bulles d’air. Avant l’impression, cette encre est équilibrée à température ambiante pendant au moins 15 min.

Bioprinting de constructions de tubules proximaux 3D perfusables

Les constructions PT 3D sont fabriquées à l’aide d’une bioprinter 3D multimatériale conçue sur mesure équipée de quatre têtes d’impression adressables indépendamment montées sur un portique à 3 axes et à commande de mouvement avec un volume de construction de 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis). Les encres sont logées dans des seringues séparées auxquelles des buses de taille variable (c.–à-d. de 50 µm à 410 µm de diamètre) sont fixées via un luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, États-Unis). Les encres sont extrudées à travers des buses de dépôt en appliquant une pression d’air (système de distribution 800 Ultra, EFD Inc., East Providence, RI, USA), allant de 10 à 90 psi, correspondant à des vitesses d’impression comprises entre 1 mm / s et 5 cm / s. Nous imprimons d’abord le joint de puce de perfusion personnalisé en déposant l’encre de silicone à travers une buse conique de 410 µm sur des lames de verre de 50 mm × 75 mm. La conception du joint est créée à l’aide d’un script MATLAB personnalisé qui génère du code G pour une structure de joint finale. Après impression, le joint de puce de perfusion est durci à 80 °C dans un four pendant > 1 h et conservé à température ambiante avant utilisation.

La modélisation des PTs 3D dans la puce de perfusion nécessite une combinaison de coulée de l’ECM et d’impression de l’encre fugitive. Tout d’abord, la solution ECM est créée en combinant 10 mg / mL de fibrinogène, 7,5% en poids de gélatine, 2,5 mm de CaCl2 et 0,2% en poids de TG. Cette solution est ensuite équilibrée à 37 °C pendant 15-20 min avant utilisation pour améliorer la clarté optique de l’ECM25. Ensuite, la solution est rapidement mélangée à de la thrombine dans un rapport de 500: 1, ce qui donne une concentration finale en thrombine de 1 U / mL. En 2 min à 37 °C, il s’ensuit une polymérisation du fibrinogène en gel de fibrine. Pour cette raison, la solution ECM doit être coulée sur la base de la puce de perfusion immédiatement après mélange avec de la thrombine. On laisse ensuite sécher légèrement la couche ECM de base sous azote, de sorte qu’elle forme une surface plane. L’encre F127 pluronique fugitive (avec 100 U/mL de thrombine) est imprimée sur la couche ECM de base sous la forme d’un filmament alambiqué (tubule) à l’aide d’une buse conique de 200 µm. Un script Python personnalisé (MeCode) est utilisé pour spécifier le chemin d’outil dans G-code. Directement après l’impression à l’encre fugitive, des broches de perfusion creuses en métal interfacées à travers le joint en silicone sont mises en contact avec l’encre imprimée. Une couche supérieure d’ECM est ensuite formée en coulant la solution d’ECM sur le tube imprimé, comme décrit ci-dessus, à 1-2 mm de la hauteur des parois du joint. Si des cellules, telles que les HNDF, sont incorporées dans l’ECM (Fig. S5), ils sont mélangés directement après la période d’équilibrage, avant le mélange de thrombine et la coulée ultérieure. Une fois la couche supérieure ECM coulée, la construction est recouverte d’une lame de verre pour éviter l’évaporation ou la contamination et est maintenue à 37 ° C pendant 1 h pour permettre la fin de la polymérisation de la fibrine et la réticulation du réseau. La construction est ensuite refroidie à 4 ° C pendant 15 à 20 minutes pour liquéfier l’encre fugitive imprimée, qui est évacuée du dispositif à l’aide de supports à cellules froides, laissant derrière elle des conduits ouverts qui servent de réseau tubulaire souhaité intégré dans l’ECM avec ou sans cellules dans l’espace ECM extra-tubulaire.

En utilisant cette méthode, nous avons également produit des architectures 3D dans une séquence de construction couche par couche. Par example, chaque couche individuelle de la structure à trois couches représentée à la Fig. S10 a été construit en utilisant un protocole d’impression modifié qui incorpore les matériaux et les méthodes précédemment discutés. Après avoir imprimé les premiers tubules avec de l’encre fugitive, une couche d’ECM est coulée sur l’impression et on laisse geler 20 min à 37 ° C avant que la couche de tubules proximaux suivante ne soit imprimée avec de l’encre fugitive au-dessus de la couche récemment gélifiée. Cette construction successive introduit une géométrie 3D et permet une évacuation réussie de tous les canaux indépendamment après la construction. Les colorants du réacteur à risque à base aqueuse sont perfusés à travers les canaux et excités avec de la lumière UV pour la visualisation.

Pour compléter le processus d’assemblage de la puce de tissu 3D, chaque construction PT est placée sur une base en acier inoxydable usinée et un couvercle en acrylique épais est placé sur le dessus. Le couvercle et la base sont serrés ensemble par quatre vis, formant un joint autour du joint en silicone imprimé. Ensuite, une tubulure péristaltique stérile à deux arrêts (BPT PharMed, diamètre interne de 0,25 mm) est remplie de fluide et connectée à la sortie d’un filtre stérile fixé à un corps de seringue de 10 ml (EFD Nordson), qui sert de réservoir de fluide. Milieu PTEC (conçu pour la croissance, donc formulation ATCC plus 1% de FBS, 1% d’aprotinine et 1% d’anti-anti) qui s’est équilibré pendant > 3 h dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO2 est ajouté au réservoir du milieu et le tube du réservoir est connecté à la sortie de la puce (broche de perfusion creuse en métal). Une seringue est ensuite utilisée pour exercer une légère pression sur le fluide dans le canon, le forçant à entrer et à remplir complètement le tube attaché. Le remplissage du tube avec du fluide avant de le connecter au circuit empêche l’introduction de bulles d’air dans le système. Pour compléter le circuit de perfusion, un tube en silicone du réservoir est connecté à la broche de perfusion métallique d’entrée sur la puce. Des pinces de pincement du tuyau sont ajoutées à l’entrée et à la sortie de la puce de perfusion pour empêcher un écoulement incontrôlé lorsqu’il est déconnecté de la pompe péristaltique, ce qui peut endommager l’épithélium ou permettre aux bulles d’air de pénétrer dans le système. Le réservoir de milieu est équilibré avec les conditions atmosphériques dans l’incubateur à tout moment au moyen d’un filtre stérile au-dessus du réservoir de milieu.

Culture cellulaire

Les PTEC immortalisés par l’homme (RPTEC/TERT1, ATCC CRL-4031) sont cultivés selon les instructions de l’ATCC et sont utilisés pour toutes les études de modèles de PT jusqu’au passage 20. Pour l’analyse de l’expression génique, les cellules cancéreuses rénales primaires humaines RPTEC (Science cellulaire), PTEC immortalisées (RPTEC-TERT1, Evercyte) et A498 (ATCC HTB-44) sont utilisées et cultivées selon les instructions du fournisseur. Les fibroblastes dermiques néonataux humains (HNDF), exprimant la GFP (Angio-Protéomie) sont cultivés selon les instructions du fournisseur et utilisés jusqu’au passage 15.

Analyse de l’expression génique

Les cellules cancéreuses rénales RPTEC primaires humaines (Science cellulaire), RPTEC-TERT1 immortalisé (Evercyte) et A498 (ATCC HTB-44) sont cultivées dans des plaques à 96 puits selon les instructions du fournisseur et collectées au jour 3 après confluence en remplaçant le milieu de culture par 100 µl / puits de mélange de lyse d’ARN 1x (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101). Ensuite, 40 µl de lysat sont mélangés à un jeu de billes magnétiques de capture d’ARNm (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, numéro de catalogue 312631), incubés pendant une nuit, traités pour une amplification de l’ADN ramifié et analysés selon les instructions du fabricant (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). La sonde PPIB est utilisée comme gène d’entretien ménager pour la normalisation. Les données d’intensité de fluorescence (FI) sont présentées sous forme de moyenne et d’écart-type de 3 répliques biologiques.

Analyse des cytokines du perfusat de milieu

Le perfusat de milieu est recueilli dans un tubule pendant une période de 25 jours après l’ensemencement des cellules et stocké à -80 °C avant l’analyse. Pour le profilage des cytokines, les surnageants sont décongelés sur de la glace, dilués 2 fois dans un tampon de dilution d’échantillon (catalogue BioRad #M60-009RDPD) et analysés par ELISA basé sur la technologie Luminex à l’aide de la Chimiokine humaine Bio-Plex Pro™ IL-6 (Set #171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) et MCP-1 (Set #171-BK36MR2) 200 Systèmes (BioRad) selon les instructions du fabricant. Les données sont présentées sous forme de concentrations moyennes de cytokines et d’écarts types de triplets techniques.

Épithélialisation et culture longitudinale

Chaque construction PT 3D est perfusée pendant plusieurs heures avec du milieu PTEC dans l’incubateur avant le chargement / ensemencement des cellules. Les PTEC (PTEC / TERT1, ATCC) sont trypsinisés à partir de leur boîte de culture et concentrés dans des milieux à ~ 2 × 107 cellules / mL. La suspension cellulaire est ensuite chargée dans la puce de perfusion par la sortie (Fig. S3b, c). La construction chargée est placée latéralement dans l’incubateur pendant plusieurs heures et retournée à 180 ° au cours de plusieurs intervalles d’une demi-heure pour permettre un ensemencement uniforme des parois du tubule, puis incubée dans le tubule sans écoulement pendant la nuit. Le lendemain, les cellules non adhérentes sont évacuées du tubule sous écoulement par gravité. La perfusion de milieux frais est alors lancée et les cellules restantes commencent à se regrouper puis à se développer à partir de ces colonies (Fig. S3f) jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence environ 3 semaines après l’ensemencement (Fig. S3k). Pendant la phase de croissance, les PTEC sont nourris avec des milieux PTEC préparés selon les directives ATCC plus 1% d’aprotinine (EMD Millipore, utilisé pour ralentir la dégradation de l’ECM), 1% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% d’antibiotique-antimycotique (Gibco). Après la maturation, le FBS est retiré et les PTECs sont emballés dans une monocouche épithéliale serrée (Film S2). Au jour 1 après l’ensemencement, les PTEC sont exposés à un écoulement continu et unidirectionnel à 1 µl/min, ce qui équivaut à des contraintes de cisaillement variant entre 0,1 et 0,5 dynes/cm2 selon la section transversale du tubule. Le fluide est alimenté par une pompe péristaltique en circuit fermé et changé tous les 2 jours.

Étude d’absorption de l’albumine

L’absorption de l’albumine est évaluée pour les modèles PT 3D imprimés ainsi que pour les témoins 2D. Le premier contrôle se compose de PTEC cultivés sur du plastique de culture tissulaire, tandis que le second contrôle se compose de PTEC cultivés sur notre ECM. Dans chaque cas, les PTEC sont cultivés jusqu’à confluence et autorisés à mûrir dans des milieux sans sérum. L’albumine sérique humaine conjuguée au FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) est mise en suspension dans des milieux PTEC à 50 µg/mL. Tous les échantillons sont incubés avec HSA-FITC dans leur milieu pendant 2 h (en cas de perfusion, il est perfusé à travers la lumière ouverte). Après exposition, tous les échantillons sont lavés avec un volume 3x puis trypsinisés avec de la trypsine 10x pour collecter les cellules individuelles. Les cellules sont fixées et contre-colorées avec des anticorps primaires et secondaires pour la mégaline (le tableau S2 répertorie les anticorps spécifiques utilisés). Les cellules de ces échantillons, et les cellules nues, sont analysées par cytométrie en flux (BD LSR Fortessa) et les données sont collectées à partir de n = 10 000 cellules par échantillon. Pour obtenir des images de HSA-FITC et de megalin dans les PTEC, les échantillons sont fixés en place avec du formol au lieu d’être essayés après l’étape de lavage. Ces échantillons sont contre-colorés pour la mégaline et imagés en microscopie confocale (Zeiss LSM710).

Test de la cyclosporine A

L’effet de la CysA sur les témoins 2D et les PTS 3D bioprintés est exploré. En 2D, les cellules sont ensemencées dans un format à 96 puits sur du plastique de culture tissulaire et cultivées jusqu’à la confluence. Ils sont alimentés en médias selon les directives de l’ATCC. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) est mise en suspension dans leur milieu à diverses concentrations et incubée avec des cellules pendant 24 h. Un essai de viabilité utilisant du (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium) en présence de méthosulfate de phénazine (MTS) est effectué au marquage 24 h après exposition. Ce dosage est complété sur les PTEC à la confluence précoce, en donnant de la CysA aux cellules le jour où elles ont atteint la confluence, ainsi qu’une confluence tardive, en donnant de la CysA plusieurs jours après leur confluence. Notamment, les résultats de toxicité sont similaires pour chaque cas (Fig. 5n). Pour les PTS 3D, la CysA est alimentée à diverses concentrations à travers la lumière ouverte des tubules matures après avoir atteint la confluence (à ~ 3 semaines), où aucun sérum n’est inclus dans le milieu pendant au moins 10 jours. Au marquage 24 h après l’exposition à la CysA, un test d’étanchéité FITC-dextran (décrit ci-dessous) est effectué pour évaluer et quantifier les perturbations de la fonction barrière des PTEC. Directement après, le PT est fixé à l’aide de formol tamponné à 10% pendant 1 h et contre-coloré pour l’actine et le DAPI (le tableau S2 répertorie les taches spécifiques utilisées).

Mesures de perméabilité diffusionnelle

Pour évaluer la fonction barrière de l’épithélium en 3D, la perméabilité diffusionnelle est quantifiée en perfusant des milieux PTEC dans la lumière ouverte contenant 25 µg/mL de dextrane 70 kDa conjugué au FITC (FITC-Dex, produit Sigma 46945) à une vitesse de 15 µL/min pendant 3 min et de 1 µL/min ensuite pendant ~ 30-45 min. L’ensemble du test est effectué sous imagerie de cellules vivantes avec à la fois le tubule et l’ECM environnante dans le champ de vision (Fig. S9). Le motif de diffusion du FITC-Dex est détecté à l’aide d’un microscope fluorescent à grand champ (Zeiss Axiovert 40 CFL). Les images de fluorescence sont capturées avant perfusion et toutes les 3 à 5 min sur une période de 30 à 45 min. La perméabilité diffusionnelle du FITC-Dex est calculée en quantifiant les changements d’intensité de fluorescence au cours du temps à l’aide de l’équation suivante34;

Pd est le coefficient de perméabilité diffusionnelle, I1 est l’intensité moyenne à un point temporel initial, I2 est une intensité moyenne à t ~ 30-45 min, Ib est l’intensité de fond (image prise avant la perfusion de FITC-Dex), et d est le diamètre du canal. D’autres chercheurs ont rapporté que les PTEC peuvent résorber le dextran39, ce qui conduirait à des valeurs légèrement plus élevées pour la perméabilité diffuse mesurée.

Nous avons également étudié les propriétés barrières de nos tubules doublés épithéliaux en utilisant un composé de faible poids moléculaire, l’inuline (4,5 kDa) qui n’est ni résorbée ni sécrétée in vivo par les PTEC en utilisant la même méthode décrite ci-dessus. Plus précisément, l’inuline-FITC (Sigma product F3272) est dissoute dans un milieu PTEC chauffé à 100 µg/mL et perfusée dans la lumière ouverte à raison de 20 µL/min pendant 3 min et de 1,5 µL/min ensuite pendant ~ 15 min. L’ensemble du test est effectué sous imagerie de cellules vivantes avec à la fois le tubule et l’ECM environnante dans le champ de vision (Fig. S7). Le schéma de diffusion de l’inuline FITC est détecté à l’aide d’un microscope fluorescent à grand champ (Leica). Les images de fluorescence sont capturées avec une source de lumière fermée et un étage contrôlé par le mouvement avant la perfusion et toutes les 3 à 5 minutes sur une période de 15 minutes pour collecter des mesures techniques en trois exemplaires.

Microscopie électronique

Pour la microscopie électronique à transmission (MET), les PTEC dans des architectures 2D ou 3D ou du tissu rénal humain sain obtenu à partir d’une biopsie standard avant la transplantation sont fixés à l’aide de glutaraldéhyde à 2,5%, de paraformaldéhyde à 1,25% et d’acide picrique à 0,03% dans un tampon cacodylate de sodium à 0,1 M (pH 7,4) pendant au moins plusieurs heures. De petits échantillons (1 mm × 1 mm) sont prélevés et lavés dans du tampon cacodylate 0,1 M et baignés dans 1% de tétroxyde d’osmium (OsO4) (EMS) et 1.5% de potassiumferrocyanure (KFeCN6) (Sigma) pendant 1 h, lavé à l’eau 3x et incubé dans de l’acétate d’uranyle aqueux à 1% (EMS) pendant 1 h, suivi de 2 lavages à l’eau et d’une déshydratation ultérieure dans différentes qualités d’alcool (10 min chacune; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Les échantillons sont ensuite mis en propylèneoxyde (EMS) pendant 1 h et incubés pendant une nuit dans un mélange 1:1 de propylèneoxyde et de TAAB Epon (Marivac Canada Inc. Saint-Laurent, Canada). Le lendemain, les échantillons sont noyés dans du TAAB Epon et polymérisés à 60 °C pendant 48 h. Des sections ultraminces (environ 60 nm) sont découpées sur un microtome Reichert Ultracut-S, placées sur des grilles de cuivre colorées au citrate de plomb et examinées au microscope électronique à transmission JEOL 1200EX et les images sont enregistrées avec une caméra CCD AMT 2k. L’analyse d’image est réalisée à l’aide du logiciel ImageJ.

Pour la microscopie électronique à balayage (MEB), les PTEC perfusés en 3D sont fixés à l’aide de formol tamponné à 10% pendant 1 h. Les échantillons sont tranchés finement (~ 1 mm d’épaisseur) pour exposer les cellules circonscrivant la lumière ouverte. Le fixateur est lavé à l’aide de PBSx2 et déshydraté ensuite dans différentes qualités d’éthanol (20 min chacune; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Les échantillons sont ensuite placés dans 50% d’éthanol et 50% d’hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant 30 min suivi de 100% de HMDS 3 × 30 min. Toutes les étapes sont effectuées dans un récipient en verre fermé et scellé. Après le lavage final avec HMDS, les échantillons sont retirés et placés dans un récipient ouvert sous N2 dans la hotte pour sécher. Les échantillons séchés sont montés sur des supports à broches en aluminium à l’aide d’un ruban de carbone conducteur, recouverts d’or et imagés avec un SEM Tescan Vega.

Immunomarquage

L’immunomarquage suivi d’une microscopie confocale est utilisé pour évaluer la localisation cellulaire des protéines dans des modèles PTEC 2D et 3D. Avant l’immunocoloration, chaque construction est lavée avec du PBS puis fixée pendant 20 min à 1 h en utilisant du formol tamponné à 10%. Le fixateur est retiré à l’aide de plusieurs lavages dans du PBS pendant plusieurs heures, puis bloqué pendant la nuit à l’aide de 1% en poids d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS. Les anticorps primaires de la protéine cellulaire ou du biomarqueur d’intérêt sont incubés avec les constructions pendant 1 jour aux dilutions énumérées dans le tableau S2 dans une solution de 0,5% en poids de BSA et de 0,125% en poids de Triton X-100. L’élimination des anticorps primaires non liés est réalisée à l’aide d’une étape de lavage contre une solution de PBS ou 0,5% en poids de BSA et 0,125% en poids de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 jour. Les anticorps secondaires sont incubés avec les constructions pendant 1 jour aux dilutions énumérées dans le tableau S2 dans une solution de BSA à 0,5% en poids et de Triton X-100 à 0,125% en poids dans le PBS. Les échantillons sont contre-colorés avec du bleu-blanc ou de l’ActinGreen pendant 2 h, puis lavés pendant 1 jour dans du PBS avant l’imagerie.

Rendu et analyse d’image

La microscopie à contrat de phase est réalisée à l’aide d’une lunette Leica DM IL inversée avec des objectifs allant de 1,25 X à 40X. La microscopie confocale est réalisée à l’aide d’un Zeiss LSM 710 vertical avec des objectifs d’immersion dans l’eau allant de 5X à 40X utilisant des lasers spectraux à des longueurs d’onde de 405, 488, 514, 561 et 633 nm. Les reconstructions d’images des piles z sont effectuées dans ImageJ à l’aide de la fonction de projection z avec le réglage d’intensité maximale des pixels. Toute augmentation de la luminosité est effectuée uniformément sur toute une image projetée en z. Les reconstructions d’images 3D et les films rotatifs (Movie S3) sont effectués à l’aide du logiciel Imaris. Le nouveau système d’incubateur CytoSMART (Lonza) est utilisé pour capturer l’imagerie en accéléré (Film S2). L’analyse d’images pour la quantification de la perméabilité diffusionnelle est réalisée à l’aide de scripts MATLAB personnalisés utilisant des méthodes précédemment rapportées34. L’analyse d’image TEM est réalisée à l’aide du logiciel ImageJ pour mesurer la hauteur des cellules (n ≥ 50), la densité des microvillosités (n ≥ 25) et la longueur des microvillosités (n ≥ 150) sur au moins 3 échantillons indépendants pour chaque condition.

Analyse statistique

Les données sont exprimées en moyennes ± écart type. L’analyse statistique est effectuée à l’aide de MATLAB et la signification statistique est déterminée à une valeur de p < 0,05 telle que déterminée par une ANOVA à l’aide du test de comparaison multiple par paires de Tukey. Différents niveaux de signification (valeurs p) sont indiqués par des astérisques et des valeurs p spécifiques sont fournies dans chaque légende de figure.