Les aptamères sont apparus comme une nouvelle catégorie dans le domaine des biorécepteurs en raison de leurs vastes applications allant du biocapteur à la thérapeutique. Plusieurs variantes de leur processus de criblage, appelé SELEX, ont été rapportées, ce qui peut donner des séquences aux propriétés souhaitées nécessaires à leur utilisation finale.

Génération d’oligonucléotides libraryEdit monocaténaire

La première étape de SELEX consiste en la synthèse de séquences oligonucléotides entièrement ou partiellement randomisées d’une certaine longueur flanquées de régions définies qui permettent l’amplification par PCR de ces régions randomisées et, dans le cas de l’ARN SELEX, la transcription in vitro de la séquence randomisée. Alors qu’Ellington et Szostak ont démontré que la synthèse chimique est capable de générer ~ 1015 séquences uniques pour les banques d’oligonucléotides dans leur article de 1990 sur la sélection in vitro, ils ont constaté que l’amplification de ces oligonucléotides synthétisés entraînait une perte significative de diversité de pool en raison du biais de PCR et des défauts dans les fragments synthétisés. Le pool oligonucléotidique est amplifié et une quantité suffisante de la banque initiale est ajoutée à la réaction de sorte qu’il existe de nombreuses copies de chaque séquence individuelle pour minimiser la perte de séquences de liaison potentielles due à des événements stochastiques. Avant que la banque ne soit introduite dans la cible pour incubation et rétention sélective, la banque de séquences doit être convertie en oligonucléotides monocaténaires pour obtenir des conformations structurelles avec des propriétés de liaison de la cible.

Incubation de la ciblemodifier

Immédiatement avant l’introduction de la cible, la banque d’oligonucléotides monocaténaire est souvent chauffée et refroidie lentement pour renaturer les oligonucléotides en structures secondaires et tertiaires thermodynamiquement stables. Une fois préparée, la banque randomisée est incubée avec une cible immobilisée pour permettre la liaison oligonucléotide-cible. Il y a plusieurs considérations pour cette étape d’incubation cible, y compris la méthode d’immobilisation cible et les stratégies de séparation ultérieure des oligonucléotides non liés, le temps et la température d’incubation, les conditions de tampon d’incubation et les concentrations cibles par rapport aux oligonucléotides. Des exemples de méthodes d’immobilisation de cibles comprennent des colonnes de chromatographie d’affinité, des filtres de dosage de liaison à la nitrocellulose et des billes paramagnétiques. Récemment, des réactions de SELEX ont été développées où la cible est des cellules entières, qui sont dilatées près de la confluence complète et incubées avec la banque d’oligonucléotides sur des plaques de culture. Les conditions du tampon d’incubation sont modifiées en fonction de la cible visée et de la fonction souhaitée de l’aptamère sélectionné. Par exemple, dans le cas de petites molécules et protéines chargées négativement, des tampons à haute teneur en sel sont utilisés pour le criblage de charge afin de permettre aux nucléotides de s’approcher de la cible et d’augmenter les chances d’un événement de liaison spécifique. Alternativement, si la fonction aptamère souhaitée est une protéine in vivo ou une liaison cellulaire entière pour une application thérapeutique ou diagnostique potentielle, des conditions de tampon d’incubation similaires aux concentrations de sel plasmatique in vivo et aux températures homéostatiques sont plus susceptibles de générer des aptamères pouvant se lier in vivo. Une autre considération dans les conditions de tampon d’incubation est les concurrents non spécifiques. S’il existe une forte probabilité de rétention d’oligonucléotides non spécifiques dans les conditions de réaction, des concurrents non spécifiques, qui sont de petites molécules ou polymères autres que la bibliothèque SELEX qui ont des propriétés physiques similaires aux oligonucléotides de la bibliothèque, peuvent être utilisés pour occuper ces sites de liaison non spécifiques. La variation de la concentration relative de la cible et des oligonucléotides peut également affecter les propriétés des aptamères sélectionnés. Si une bonne affinité de liaison pour l’aptamère sélectionné n’est pas un problème, alors un excès de cible peut être utilisé pour augmenter la probabilité qu’au moins certaines séquences se lient pendant l’incubation et soient conservées. Cependant, cela ne fournit pas de pression sélective pour une affinité de liaison élevée, ce qui nécessite que la banque d’oligonucléotides soit en excès de sorte qu’il y ait une compétition entre des séquences uniques pour des sites de liaison spécifiques disponibles.

Elution et amplification de séquences de liaison

Une fois que la banque d’oligonucléotides a été incubée avec la cible pendant un temps suffisant, des oligonucléotides non liés sont lavés de la cible immobilisée, souvent en utilisant le tampon d’incubation de sorte que des oligonucléotides spécifiquement liés sont conservés. Avec des séquences non liées emportées, les séquences spécifiquement liées sont ensuite éluées en créant des conditions dénaturantes qui favorisent le déploiement d’oligonucléotides ou la perte de conformation de liaison, y compris l’écoulement dans de l’eau désionisée, en utilisant des solutions dénaturantes contenant de l’urée et de l’EDTA, ou en appliquant une chaleur et une force physique élevées. Lors de l’élution des séquences liées, les oligonucléotides retenus sont transcrits en ADN inverse dans le cas d’ARN ou de sélections de bases modifiées, ou simplement collectés pour amplification dans le cas d’ADN SELEX. Ces modèles d’ADN à partir de séquences éluées sont ensuite amplifiés par PCR et convertis en ADN simple brin, ARN ou oligonucléotides de base modifiés, qui sont utilisés comme entrée initiale pour le prochain cycle de sélection.

Obtention de ssDNAEdit

L’une des étapes les plus critiques de la procédure SELEX consiste à obtenir de l’ADN simple brin (ssDNA) après l’étape d’amplification par PCR. Cela servira d’entrée pour le prochain cycle, il est donc d’une importance vitale que tout l’ADN soit simple brin et que le moins possible soit perdu. En raison de la relative simplicité, l’une des méthodes les plus utilisées consiste à utiliser des amorces inverses biotinylées dans l’étape d’amplification, après quoi les brins complémentaires peuvent être liés à une résine suivie d’une élution de l’autre brin avec de la lessive. Une autre méthode est la PCR asymétrique, où l’étape d’amplification est réalisée avec un excès d’amorce avant et très peu d’amorce inverse, ce qui conduit à la production d’une plus grande partie du brin souhaité. Un inconvénient de cette méthode est que le produit doit être purifié à partir d’ADN double brin (ADNDSD) et d’autres matériaux restants de la réaction de PCR. La dégradation enzymatique du brin indésirable peut être réalisée en marquant ce brin à l’aide d’une amorce sondée au phosphate, car elle est reconnue par des enzymes telles que la Lambda exonucléase. Ces enzymes dégradent alors sélectivement le brin marqué au phosphate en laissant le brin complémentaire intact. Toutes ces méthodes permettent de récupérer environ 50 à 70% de l’ADN. Pour une comparaison détaillée, reportez-vous à l’article de Svobodová et al. où ces méthodes, et d’autres, sont comparées expérimentalement. Dans le SELEX classique, le processus de génération de bibliothèque monocaténaire randomisée, d’incubation cible, d’élution et d’amplification de séquences de liaison décrit ci-dessus est répété jusqu’à ce que la grande majorité du pool retenu soit constituée de séquences de liaison cible, bien qu’il y ait des modifications et des ajouts à la procédure qui sont souvent utilisés, qui sont discutés ci-dessous.

Sélection négative ou contre-sélectionEdit

Afin d’augmenter la spécificité des aptamères sélectionnés par une procédure SELEX donnée, une étape de sélection négative, ou de contre-sélection, peut être ajoutée avant ou immédiatement après l’incubation cible. Pour éliminer des séquences ayant une affinité pour les composants de la matrice d’immobilisation cible du pool, une sélection négative peut être utilisée lorsque la bibliothèque est incubée avec des composants de la matrice d’immobilisation cible et que des séquences non liées sont conservées. La sélection négative peut également être utilisée pour éliminer les séquences qui lient des molécules ou des cellules de type cible en incubant la banque d’oligonucléotides avec des analogues cibles de petites molécules, des types cellulaires indésirables ou des protéines non cibles et en conservant les séquences non liées.

Suivi de la progression de la sélectiondit

Pour suivre la progression d’une réaction de SELEX, le nombre de molécules liées à la cible, qui est équivalent au nombre d’oligonucléotides élués, peut être comparé à l’apport total estimé d’oligonucléotides après élution à chaque tour. Le nombre d’oligonucléotides élués peut être estimé par des estimations de concentration en élution via une absorbance de longueur d’onde de 260 nm ou un marquage fluorescent des oligonucléotides. Lorsque la réaction de SELEX approche de la fin, la fraction de la banque d’oligonucléotides qui se lie à la cible approche de 100%, de sorte que le nombre de molécules éluées se rapproche de l’estimation totale de l’apport d’oligonucléotides, mais peut converger à un nombre plus faible.

Mises en garde et considérationsEdit

Certaines réactions de SELEX peuvent générer des sondes qui dépendent des régions de liaison des amorces pour la formation de structures secondaires. Il existe des applications aptamères pour lesquelles une séquence courte, et donc une troncature d’amorce, est souhaitable. Une avancée sur la méthode originale permet à une banque d’ARN d’omettre les régions d’amorces constantes, qui peuvent être difficiles à éliminer après le processus de sélection car elles stabilisent des structures secondaires instables lorsqu’elles sont formées par la seule région aléatoire.