Sujets d’étude, échantillons cliniques et génotypage HLA. Tous les sujets ayant des antécédents de transfusion sanguine ont été exclus de l’étude. Trente-deux familles ayant des antécédents de sclérodermie simplexe ont été recrutées et étudiées pour les allèles HLA de classe II et de classe I; 3 générations ont été étudiées pour 20 familles et 2 générations pour 12 familles. Trois générations étaient nécessaires pour l’entrée aux études de toutes les femmes ayant des enfants, et la participation de tous les enfants était requise car le microchimérisme pouvait provenir de la mère ou d’un enfant dans ces sujets. La participation des hommes, des enfants et des femmes jamais enceintes comprenait 2 générations (c’est-à-dire le sujet et la mère). Un patient sclérodermique était un jumeau; le jumeau non affecté a également été recruté pour l’étude. Trente-trois familles de contrôle en bonne santé ont été recrutées, dont 22 avec 3 générations et 11 avec 2 générations. Le génotypage HLA a été réalisé pour un total de 254 individus: 128 dans les familles de sclérodermie et 126 chez les témoins. Certains membres de la famille supplémentaires ont été inclus pour confirmer les affectations d’haplotype HLA. À partir de cette base de données, des sujets ont été sélectionnés pour une étude plus approfondie lorsque la mère du sujet avait un allèle HLA non partagé ciblé par des tests spécifiques à HLA. Tous les sujets ont obtenu un consentement éclairé tel qu’approuvé par le Conseil d’examen institutionnel du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson.

Les PBMC ont été isolés du sang entier hépariné par dilution dans des HBSS, suivie d’une centrifugation par gradient de Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suède) à 1,077 g/mL. Pour certains enfants, l’ADN a été extrait des racines des cheveux pour le typage HLA comme décrit précédemment (9). L’ADN génomique a été extrait de PBMC à l’aide d’un kit d’extraction nucléique Isoquick (Orca Research Inc., Bothell, Washington, États-Unis), selon les instructions du fabricant, et remis en suspension dans du Tris-HCl de 10 mM (pH 9,0). La quantité et la pureté de l’ADN ont été déterminées par des méthodes spectrophotométriques standard. Pour certains sujets, l’ADN a été extrait directement d’échantillons de sang total.

Un typage basé sur l’ADN avec des panneaux de sondes oligonucléotidiques spécifiques à la séquence a été utilisé pour identifier des allèles spécifiques aux loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 et DQB1. Pour DRB1, un test initial à basse résolution détecte les familles de DRB1 DBR1*01 à DRB1*14 et est suivi d’au moins 1 test à haute résolution qui identifie des allèles DRB1 spécifiques tels que décrits précédemment (10, 11). Les allèles DQA1 et DQB1 ont été déterminés à l’aide de méthodes similaires à celles décrites précédemment (9), avec l’ajout de sondes supplémentaires pour détecter les allèles nouvellement identifiés (12). Les antigènes HLA de classe I ont été déterminés à l’aide d’un test de lymphocytotoxicité standard qui distingue 20 antigènes HLA-A, 30 HLA-B et 8 antigènes HLA-Cw. Certains échantillons ont été soumis à un séquençage pour déterminer des allèles spécifiques de classe I HLA (13). Pour confirmer les attributions et l’homozygotie de l’allèle et de l’antigène HLA, plusieurs membres de la famille ont été génotypés, y compris les pères et les frères et sœurs des sujets, lorsqu’ils étaient disponibles.

Amorces PCR spécifiques à HLA. Les séquences d’amorces ont été conçues sur la base de toutes les séquences d’allèles connues (12). La synthèse d’amorces a été réalisée par Oligos, etc. (Wilsonville, Oregon, États-Unis). Un ensemble d’amorces a été conçu pour cibler un polymorphisme de classe HLA I et 3 polymorphismes de classe HLA II ciblés. Pour cibler HLA-B44, on a conçu une amorce qui amplifie un groupe d’allèles HLA-B basé sur des polymorphismes aux positions 66, 69 et 75 de l’exon 3 et un autre groupe d’allèles HLA-B basé sur un polymorphisme à la position 229 de l’exon 3. La combinaison d’amorces amplifie spécifiquement les allèles HLA-B44, produisant un fragment de 190 pb. Toutes les amorces spécifiques à DRB ont été conçues pour amplifier les groupes allèles en fonction des polymorphismes de séquence dans la région hypervariable de l’exon 2. Pour HLA-DRB5*01, une amorce amplifie un groupe d’allèles DRB5* 01 basé sur des polymorphismes aux positions 25, 26, 31, 32 et 38, et l’autre amplifie un groupe d’allèles DRB5* 01 basé sur des polymorphismes entre les positions 215 et 231. La combinaison d’amorces amplifie spécifiquement les allèles HLA-DRB5*01, produisant un fragment de 210 pb. Pour HLA-DRB1* 04, une amorce amplifie un groupe d’allèles DRB1 * 04 basés sur des polymorphismes aux positions 25, 26, 31 et 36, et l’autre amplifie un groupe d’allèles DRB1 * 04 basés sur des polymorphismes aux positions 97 et 110. La combinaison d’amorces amplifie spécifiquement DRB1*04, produisant un fragment de 104 pb. Une autre discrimination parmi les allèles DRB1*04 a été obtenue en utilisant la première amorce ainsi que 1 des 2 amorces qui discriminent un dimorphisme en position 258 (codon 86), produisant un fragment de 263 pb. Pour HLA-DRB1 *11, une amorce amplifie un groupe d’allèles DRB1 *11 basé sur des polymorphismes aux positions 25, 26, 28, 30, 31, 32, et 35 de l’exon 2, et la seconde amorce amplifie un groupe d’allèles DRB1*11 basés sur des polymorphismes aux positions 173 et 174 de l’exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. Des réactions de PCR ont été réalisées dans un volume de 50 µL contenant 1,25–1,5 µg d’ADN génomique, 10 mmol/L de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L de KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% en poids/vol de gélatine, 260 µmol/L de chaque désoxynucléotide, 0,5 U Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, Californie, États-Unis), 2,5 U d’AmpliTaq ADN polymérase d’or (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis) et 20 pmol de chaque amorce spécifique à HLA. De l’eau ultrapure a été ajoutée pour constituer le volume final de 50 µL. L’amplification a consisté en 5 minutes à 96°C, 35 cycles à 95°C pendant 35 secondes, et à 65°C pendant 35 secondes pour HLA-B44 (58,5°C pour DRB5*01 ; 72°C pour DRB1*04; 64,5°C pour DRB1*11), puis 72°C pendant 1 minute, avec une étape finale d’extension à 72°C pendant 10 minutes. Une amplification, une sensibilité et une spécificité optimales ont été obtenues en titrant le MgCl2, les concentrations d’amorces, le nombre de thermocycles et la température de recuit. Toutes les amplifications ont été effectuées dans un thermocycleur GeneAmp System 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La sensibilité du test a été déterminée par des expériences de dopage dans lesquelles de l’ADN cible a été dilué en série et ajouté à une quantité fixe d’ADN de fond correspondant aux allèles du sujet. Les tests de PCR spécifiques à HLA-B44 et DRB5 * 01 ont pu détecter au moins 1 cellule cible dans un fond de 500 000 cellules; les tests de PCR spécifiques à HLA–DRB1 * 04 et DRB1 * 11 ont pu détecter au moins 1 cellule cible dans un fond de 100 000 cellules. Chaque essai de PCR comprenait les contrôles suivants: (a) un contrôle positif de l’ADN d’une lignée cellulaire avec l’allèle HLA d’intérêt (0,2-0,5 µg); (b) un contrôle positif de la mère du sujet (0,2–0,5 µg); (c) des contrôles négatifs d’ADN d’une lignée cellulaire avec les mêmes allèles HLA que le sujet (1,25 µg et 0,35 µg); et (d) un contrôle négatif composé de tous les réactifs de PCR sans ADN. Les produits PCR ont été électrophorés à tension constante de 100 V pendant 1 heure dans des gels TBE préfabriqués à 6% ou 8% à l’aide d’une mini-cellule Novex Xcell II (Novex, San Diego, Californie, États-Unis). Chaque gel comprenait des contrôles PCR positifs et négatifs et une échelle de 100 pb (SLL-100; Gensura, Del Mar, Californie, États-Unis). Les gels ont été colorés avec de la teinture d’argent (Kit de teinture d’argent Plus, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Californie, États-Unis) et séché avec le système de séchage au gel DryEase (Novex). L’ADN extrait du sang total a été testé dans 4 échantillons en quantité insuffisante pour isoler les PBMC. Tous les tests ont été effectués en double exemplaire et la plupart des échantillons ont été analysés plus d’une fois.

Mesures de précaution par PCR. Une extrême prudence a été utilisée pour éviter et détecter une éventuelle contamination par PCR. Des zones distinctes ont été utilisées pour la séparation des PBMC, l’extraction de l’ADN génomique, la configuration et l’amplification de la PCR et l’analyse des produits de PCR, avec des tests de PCR avant et après effectués dans des laboratoires distincts. Embouts de pipettes résistants aux aérosols (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Californie, États-Unis) ont été utilisés dans toutes les expériences, et de multiples contrôles négatifs ont été inclus dans toutes les amplifications PCR.

Séquençage de produits PCR spécifiques à HLA. Sept microlitres du produit de PCR spécifique de HLA initial ont été soumis à 40 cycles supplémentaires d’amplification en utilisant les paramètres de thermocyclage d’origine. Trente microlitres de ce produit PCR ont été électrophorés dans un gel d’agarose ultrapure à 1,75% (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) et colorés avec une solution de bromure d’éthidium (0,5 µg/mL). La bande a été excisée, éluée et purifiée à l’aide d’un kit d’extraction de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, Californie, États-Unis). Le produit PCR purifié a été élué dans 30 µL de Tris-HCl 10 mmol (pH 9,0) et 100 ng ont été ajoutés à un mélange réactionnel contenant 8,0 µL de pré-mélange de réactif de séquençage (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.apprêt 5 pmol 5′ ou 3′, et 1 µL de DMSO (Sigma Chemical Co., Saint-Louis, Missouri, États-Unis). De l’eau ultrapure a été ajoutée pour obtenir un volume final de 20 µL. Les mélanges réactionnels de séquençage ont été chauffés à 96°C pendant 3 minutes dans un thermocycleur GeneAmp System 9600, suivi de 25 cycles à 96°C pendant 10 secondes, 50°C pendant 5 secondes et 60°C pendant 4 minutes. Les produits PCR obtenus ont été purifiés sur colonne et électrophorés comme ci-dessus. Des séquences sensorielles et antisens ont été déterminées en double pour les produits de PCR spécifiques à HLA du sujet et de la mère, ainsi que pour les produits de PCR de lignée cellulaire témoin positive. L’analyse de séquence a été réalisée à l’aide du logiciel Wisconsin Package version 9.1 de Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, États-Unis).

Préparation de lames de cytospine et hybridation in situ. Des préparations de lames de Cytospine ont été analysées pour la présence de séquences spécifiques aux chromosomes X et Y, à l’aide d’une technique développée dans le laboratoire de cytogénétique moléculaire du Fred Hutchinson Cancer Research Center pour l’analyse quantitative du chimérisme dans des paires de greffes de cellules souches non appariées selon le sexe (14). Des échantillons de cytospines de cellules mâles ont été préparés par centrifugation de 30 000 à 60 000 PBMC fraîchement séparés sur des lames de verre, à raison de 300 µL par lame. Les lames ont été stockées dans une chambre de dessiccation jusqu’à leur utilisation. La sonde spécifique au chromosome X DXZ1 (15) a été traduite par la digoxigénine et la sonde spécifique au chromosome Y DYZ1 (16) a été traduite par la biotine. Le mélange de sondes XY avait une concentration finale de 0,5 µg / mL de chaque sonde dans un tampon d’hybridation de 50% de formamide, 2× SSC (chlorure de sodium 0,3 M et citrate de sodium 0,03 M) et 10% de sulfate de dextrane. Il a été dénaturé à 72 ° C pendant 5 minutes, refroidi sur de la glace et appliqué sur la lame. Les lames ont été digérées dans de la pepsine (0,1 mg/mL en 0.01 M HCl) à 37 ° C pendant 3 minutes, fixé dans du formol tamponné à 4% pendant 15 minutes, rincé dans du PBS, déshydraté dans de l’éthanol (70%, 95% et 100%) et séché à l’air. Les lames ont été dénaturées par traitement à 2× SSC (72 ° C) pendant 10 minutes, formamide à 70%, 2 × SSC (72 °C) pendant 3 minutes, déshydratées dans une série d’éthanol (-20 ° C) et séchées à l’air. Dix microlitres de sonde ont été appliqués sur la glissière puis montés sous une lamelle (22 × 22 mm) scellée avec du ciment caoutchouc. Il a été incubé pendant une nuit à 42°C dans une chambre humidifiée. Les lames ont été lavées dans du formamide à 55%, 2× SSC (45 ° C) pendant 15 minutes et 2× SSC (température ambiante) pendant 5 minutes. Des signaux de sonde ont été détectés simultanément avec de l’anti-digoxigénine couplée à la fluorescéine (dilution 1: 500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, États-Unis) et de l’avidine couplée au rouge du Texas (dilution 1: 500; Vector Laboratories, Burlingame, Californie, États–Unis) pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après lavage avec 2× SSC et PBS, ils ont été montés avec VECTASHIELD (Vector Laboratories). Les lames ont été évaluées directement à l’aide d’un microscope à épifluorescence Nikon E600 avec une lampe au mercure de 100 W équipée de filtres passe-bande simples, doubles et triples appropriés. Seules les cellules avec 2 signaux chromosomiques visibles ont été dénombrées, sans utiliser d’amélioration électronique.