2.1 Respiration anaérobie

Pendant la respiration, différentes déshydrogénases associées à la membrane oxydent les substrats solubles dans l’eau et réduisent la ménaquinone (MK) dans la membrane en ménaquinol. Dans des conditions aérobies, les électrons sont utilisés pour réduire l’oxygène en eau, tandis que dans des conditions anaérobies, les électrons de croissance respiratoire du nitrate sont transférés au nitrate pour donner du nitrite (Fig. 5.1). L’un des principaux donneurs d’électrons de la respiration est le NADH + H+ produit lors de la glycolyse et du cycle de l’acide tricarboxylique. Deux types de NADH déshydrogénases liées à la membrane, NDH-I et NDH-II, ont été décrits pour que les bactéries catalysent l’oxydation du NADH + H + en NAD + (Yagi, 1993). NDH-I se compose de 14 sous–unités, codées par l’opéron nuo d’Escherichia coli, et contient du mononucléotide de flavine (FMN) et plusieurs amas fer-soufre pour coupler le transfert d’électrons au pompage de protons à travers la membrane. NDH-II est constitué d’une seule sous-unité codée par le gène ndh. La NDH-II n’est pas une protéine membranaire intégrale mais associée à la face interne de la membrane cytoplasmique. Il contient de la flavine adénine dinucléotide (FAD) en tant que groupe prothétique et le transfert d’électrons n’est pas couplé à la translocation de protons. Dans le génome de B. subtilis, trois gènes, yjlD, yumB et yutJ, codent des NADH déshydrogénases potentielles de type NDH-II, alors qu’un opéron nuo est absent du génome de B. subtilis (Kunst et al., 1997). YjlD, rebaptisé Ndh, est constitué de 392 résidus d’acides aminés et présente une identité de séquence de 29% avec NDH-II d’E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Fait intéressant, la quantité de protéine Ndh de B. subtilis a été significativement réduit dans des conditions anaérobies (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, &Jahn, 2000). La Ndh semble être la principale NADH déshydrogénase aérobie de B. subtilis, car la mutation du gène ndh présentait un défaut de croissance aérobie (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, &Sato, 2006). Pendant ce temps, il a été montré que l’expression de l’opéron yjlC-ndh est régulée par le régulateur Rex, un régulateur transcriptionnel à détection redox, qui répond au rapport NADH/NAD+ (voir également Section 3.3) (Gyan et al., 2006). En revanche, l’expression du gène yumB a été trouvée induite dans des conditions respiratoires au nitrate dans des études sur le transcriptome (E. Härtig, résultats non publiés). Il faut déterminer si YumB et YutJ ont une activité de la NADH déshydrogénase, comme le suggère la similitude des séquences protéiques, et si elles sont pertinentes dans des conditions de croissance respiratoire des nitrates.

Comme d’autres organismes à respiration aérobie, B. subtilis possède une succinate déshydrogénase (sdh) ou plus précisément un succinate : quinone oxydoréductase, SQR (Hägerhäll, 1997). Le complexe enzymatique fait partie intégrante de la membrane cytoplasmique chez les bactéries et de la membrane mitochondriale interne chez les eucaryotes. Il catalyse l’oxydation du succinate en fumarate couplée à la réduction de la quinone. Ainsi, l’enzyme fait partie fonctionnelle à la fois du cycle de l’acide citrique et de la chaîne respiratoire (Hägerhäll, Aasa, von Wachenfeldt, Hederstedt, 1992). SQR dans B. subtilis réduit la MK et possède trois sous-unités protéiques, SdhA, SdhB et SdhC. La SdhA est une flavoprotéine avec une DCP liée de manière covalente qui effectue l’oxydation à deux électrons du succinate en fumarate dans le cytoplasme. Le SdhB contient trois amas fer–soufre (,, et) qui fonctionnent dans le transfert d’électrons entre le groupe flavine et l’hème b du cytochrome b558 dans le SdhC. SdhC a cinq segments α-hélicoïdaux transmembranaires et ancre le dimère SdhAB du côté cytoplasmique de la membrane et fonctionne dans le transfert d’électrons transmembranaires vers MK (Hederstedt, Maguire, Waring, &Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoï, Aasa, &Hederstedt, 1985; Matsson, Tolstoï, Aasa, &Hederstedt, 1985 2000). Les deux cofacteurs de l’hème b assurent la médiation du transfert des électrons à travers la membrane cytoplasmique vers le côté externe de la membrane au niveau de laquelle MK est réduit et deux protons sont consommés (Hederstedt, 2002). Ceci est différent de E. coli où les protons pour la réduction de l’ubiquinone en ubiquinol sont consommés du côté négatif de la membrane, ce qui n’affecte pas le potentiel membranaire. B. subtilis et d’autres bacilles, tels que les souches de Bacillus megaterium et de Bacillus cereus, peuvent se développer dans des conditions oxiques avec du succinate comme source de carbone et d’énergie (Schirawski&Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium et B. cereus ne poussent pas en conditions anaérobies en présence de glycérol. En accord, les gènes d’une glycérol-3-déshydrogénase sont manquants dans les génomes. Cependant, un gène glpD pour la variante aérobie du système de transfert d’électrons localisé dans la membrane a été détecté chez B. subtilis. Aucune homologie n’a été trouvée avec les gènes codant pour d’autres déshydrogénases primaires présentes chez E. coli telles que diverses formiates déshydrogénases, hydrogénases, l-lactate déshydrogénase, d-acide aminé déshydrogénase, malate: quinone oxydoréductases ou la quinoprotéine glucose déshydrogénase. De toute évidence, B. subtilis ne possède qu’un ensemble limité de déshydrogénases primaires donneuses d’électrons, à savoir diverses formes de NDH-II et de glycérol-3-phosphate déshydrogénase aérobie.

Dans des conditions aérobies, les électrons sont transmis du ménaquinol via le complexe cytochrome bc1 à la cytochrome c oxydase de type aa3. En condition microaérophile, la ménaquinol oxydase de type cytochrome bd à haute affinité pour l’oxygène est utilisée. Le fumarate comme accepteur d’électrons terminaux a été exclu pour divers bacilles, dont B. subtilis (Schirawski&Unden, 1995). Par conséquent, les gènes d’une fumarate réductase ne se trouvent pas dans le génome de B. subtilis. D’autres souches de bacilles, telles que Bacillus licheniformis et Bacillus circulans, peuvent respirer du fumarate comme E. coli.

Dans des conditions de croissance anaérobie, B. subtilis transfère les électrons exclusivement à la nitrate réductase respiratoire. Chez les bactéries, trois systèmes de nitrate réductases différents sont classés: les nitrates réductases cytoplasmiques assimilatrices NAD (P) H dépendantes (Nas), la nitrate réductase respiratoire liée à la membrane (Nar) et les nitrates réductases dissemblables périplasmiques (Nap). Tous les trois appartiennent à la famille des protéines DMSO réductases et contiennent le cofacteur bis-molybdoptérine guanine dinucléotide (MGD) (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, &Castillo, 1999). Le génome de B. subtilis code uniquement pour la nitrate réductase respiratoire Nar. Les enzymes Nar sont généralement composées de trois sous-unités. La grande sous-unité NarG contient le site actif avec le cofacteur MGD, une sous-unité soluble plus petite NarH abrite un et trois centres, et la sous-unité NarI est un cytochrome b. Nar est une quinol oxydase et le pool de ménaquinol est oxydé par la sous-unité du cytochrome b NarI. Deux électrons circulent via l’hème b de NarI vers les amas fer–soufre de NarH et enfin vers la sous-unité cytoplasmique NarG qui réduit le nitrate en nitrite. La protéine NarJ ne fait pas partie de l’enzyme mais est nécessaire à l’assemblage final de l’enzyme liée à la membrane (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, &Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). En raison des différents sites d’oxydation du quinol dans le périplasme et de réduction du nitrate dans le cytosol, la nitrate réductase Nar contribue à la génération d’un gradient de protons (Fig. 5.1). Le locus nar est constitué de l’opéron narGHJI (codant pour la nitrate réductase respiratoire), du narK (pour une protéine potentielle d’extrusion de nitrites), du cadre de lecture ouvert ywiC (de fonction inconnue), de l’arfM codant pour le modulateur de la respiration anaérobie et de la fermentation, ainsi que du gène du régulateur anaérobie Fnr (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et coll., 1997).

Le nitrite est ensuite converti en ammoniac par la nitrite réductase assimilatrice NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, &Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano &Zuber, 1998). La nitrite réductase NADH-dépendante assimilatrice ou productrice d’ammonium est une enzyme contenant du sirohème qui catalyse la réduction de six électrons du nitrite en ammonium. Les gènes de nitrite réductase nasDE faisaient partie d’un opéron nasDEF et se trouvaient immédiatement en aval de l’opéron nasBC, qui code pour la nitrate réductase NADH-dépendante (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).