Résumé

Le myoépithélium est présent dans les tumeurs mammaires canines sous forme de cellules interstitielles suprabasales et fuselées et stellaires au repos et prolifératives. Le but de cet article était d’évaluer un panel de marqueurs pour l’identification de quatre types morphologiques de cellules myoépithéliales différentes dans la glande mammaire normale et néoplasique et d’étudier les modifications immunohistochimiques d’un phénotype épithélial à un phénotype mésenchymateux. Les anticorps cytokératine 19 (CK19), cytokératine 5/6 (CK5 / 6), cytokératine 14 (CK14), récepteur des œstrogènes (ER), protéine p63, vimentine (VIM) et actine du muscle α-lisse (Alpha-SMA) ont été utilisés sur 29 néoplasmes (3 tumeurs myoépithéliales bénignes et 3 malignes, 7 carcinomes dans les tumeurs mixtes bénignes et 16 carcinomes complexes) et sur le tissu normal des glandes mammaires. Tous ces anticorps ont également été testés sur 3 tissus mammaires d’animaux sans pathologie mammaire. Les marqueurs myoépithéliaux étaient bien exprimés dans les cellules suprabasales et progressivement perdus dans les types mobiles, les cellules étoilées ne conservant que l’expression VIM typique du mésenchyme. ER a marqué certaines cellules myoépithéliales au repos et mobiles. Sur la base de nos résultats, nous proposons une transition des cellules immotiles myoépithéliales vers des cellules migratrices de type fibroblaste. Cette transition et la caractérisation d’un panel immunohistochimique pour les cellules myoépithéliales au repos et mobiles apportent plus de lumière sur le comportement biologique des cellules myoépithéliales.

1. Introduction

Les tumeurs des glandes mammaires des chiens sont formées à la fois par des composants épithéliaux (épithélium et myoépithélium) et mésenchymateux. L’origine des cellules mésenchymateuses est encore débattue. La fréquence élevée des tumeurs présentant une prolifération myoépithéliale ou basale est une caractéristique unique des tumeurs mammaires canines.

Dans la glande mammaire normale, les lumines sont délimitées par une couche interne de cellules épithéliales polarisées reposant sur deux couches externes ou basales de cellules épithéliales et myoépithéliales. Les cellules basales et myoépithéliales synthétisent la membrane basale des canaux et des alvéoles et forment une barrière structurelle entre les cellules épithéliales luminales et le stroma environnant. Dans les canaux, les cellules myoépithéliales forment une couche presque continue de cellules orientées parallèlement au grand axe des canaux. Cette couche entoure les cellules épithéliales luminales et les sépare de la membrane basale et du stroma. Dans les alvéoles, les cellules myoépithéliales sont discontinues, formant un réseau en forme de panier autour des alvéoles, permettant à certaines cellules épithéliales luminales de contacter directement la membrane basale. Par conséquent, le myoépithélium est non seulement situé dans une position idéale pour communiquer entre ces deux compartiments, mais il est également positionné pour fournir des signaux régulateurs importants pour le maintien d’une structure cellulaire normale.

Sur la base de l’immunohistochimie, les trois couches de cellules de la glande mammaire normale présentent des marqueurs différents: l’épithélium luminal est marqué par CK19, et les cellules basales et les cellules myoépithéliales sont colorées par CK5 / 6 et CK14 et p63, Alpha-SMA et VIM. Les cellules myoépithéliales sont des éléments contractiles présentant un immunoprofile épithélial et musculaire lisse combiné. Les marqueurs mentionnés ci-dessus sont exprimés dans le cytoplasme, à l’exception de p63 qui est un marqueur nucléaire. La couche de cellules myoépithéliales est la seule source de suppresseur de tumeur p63, qui est significativement inhibée lors de la prolifération et de l’invasion des cellules tumorales associées. De plus, les cellules myoépithéliales basales de la glande mammaire normale sont parfois marquées par un anticorps ER, qui est utilisé pour la classification moléculaire des tumeurs mammaires canines.

Des morphologies distinctes de cellules myoépithéliales peuvent être reconnues dans les tumeurs complexes et mixtes canines: cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives et cellules myoépithéliales interstitielles mobiles fuselées et étoilées. Les cellules suprabasales sont situées entre la membrane basale et l’épithélium luminal et présentent des morphologies fuselées aplaties (cellules au repos) ou polygonales (cellules prolifératives). Les cellules interstitielles sont fréquemment disposées dans des nids solides apposés sur des éléments épithéliaux ou isolés dans l’interstitium. Les cellules myoépithéliales fuselées et étoilées se différencient vers un phénotype contractile plus général.

Les cellules myoépithéliales interstitielles peuvent éventuellement devenir des cellules de type fibroblaste, ne présentant qu’une immunoréactivité VIM. La différenciation myoépithéliale peut aboutir à la formation de divers tissus mésenchymateux, y compris le cartilage et l’os dans la tumeur mixte mammaire canine.

L’acquisition des caractéristiques typiques des cellules mésenchymateuses est susceptible de provenir de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). L’EMT est un phénomène biologique qui permet à une cellule épithéliale polarisée, qui interagit normalement avec la membrane basale via sa surface basale, de subir de multiples modifications biochimiques lui permettant d’assumer les traits et les fonctions des cellules mésenchymateuses.

Cet article se concentrera sur divers aspects des cellules myoépithéliales et des tumeurs mammaires chez le chien, en particulier (1) la caractérisation des quatre types morphologiques de cellules myoépithéliales différentes dans la glande mammaire normale et néoplasique à l’aide d’un panel d’anticorps et (2) les changements immunohistochimiques dans les cellules myoépithéliales d’un phénotype épithélial à un phénotype mésenchymateux.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Des échantillons de glandes mammaires de 29 chiennes ont été extraits de la base de données du Service d’Anatomopathologie de la Faculté de Médecine Vétérinaire de Bologne. Les sujets appartenant à différentes races: mongrel (𝑛=13), berger allemand (𝑛=3), le Caniche (𝑛=3), le Yorkshire Terrier (𝑛=3), le Teckel (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Pointeur (𝑛=1), le Cocker (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), et Husky Sibérien (𝑛=1); ils étaient tous des femelles, avec une moyenne d’âge de 9.20±2.28 ans (moyenne ± SD). Les tumeurs se composaient de: 3 tumeurs myoépithéliales bénignes, 3 tumeurs myoépithéliales malignes, 7 carcinomes dans les tumeurs mixtes bénignes et 16 carcinomes complexes (les deux derniers groupes étaient différenciés par la présence de cartilage et / ou d’os dans les tumeurs mixtes). De plus, 29 échantillons de glandes mammaires normales de la même lignée tumorale et 3 échantillons mammaires de 3 chiennes porteuses de tumeurs non mammaires saines ont été évalués.

Les tumeurs ont été classées selon Misdorp et al. et Goldschmidt et coll. tumeurs myoépithéliales bénignes: néoplasme rare composé de cellules myoépithéliales disposées en faisceaux courts mélangés à un matériau basophile fibrillaire extracellulaire; tumeurs myoépithéliales malignes: différentes de la variante bénigne avec des cellules myoépithéliales plus polymorphes; carcinome complexe: carcinome composé à la fois de composants épithéliaux luminaux et myoépithéliaux; carcinome dans une tumeur bénigne: tumeur avec des foyers de cellules épithéliales d’apparence maligne ou des nodules distincts de ces cellules se produisant avec des cellules mésenchymateuses qui ont produit du cartilage et / ou de l’os éventuellement en combinaison avec du tissu fibreux.

2.2. Immunohistochimie

Des coupes de quatre µm d’épaisseur ont été découpées dans des blocs de paraffine fixés au formol contenant des échantillons tumoraux représentatifs. L’immunohistochimie des marqueurs suivants a été réalisée sur ces tissus: CK19, ER, CK5/6, CK14, VIM, Alpha-SMA, p63.

Les sections ont été déparaffinées au toluène et réhydratées. La peroxydase endogène est bloquée par immersion dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3% pendant 20 min. Les sections ont ensuite été rincées dans du tampon Tris. La récupération de l’antigène a été réalisée avec du tampon citrate (2,1 g d’acide citrique monohydraté / litre d’eau distillée), pH 6,0 (sauf pour CK5 / 6 et ER, qui utilisaient de l’EDTA, pH 8,0), et chauffage pendant deux périodes de 5 min dans un four à micro-ondes à 750 W, suivi d’un refroidissement à température ambiante pendant 20 min. Les anticorps primaires sont résumés dans le tableau 1. Tous les anticorps primaires ont été incubés pendant une nuit à 4°C, suivi d’une technique commerciale de streptavidine-biotine-peroxydase (Kit LSAB, Dako, Amsterdam, Pays-Bas). La diaminobenzidine (0,05% pendant 10 min à température ambiante) a été utilisée comme chromogène. Les lames ont été contre-colorées avec l’hématoxyline de Papanicolaou.

En tant que témoin négatif, l’anticorps primaire a été remplacé par un anticorps non pertinent adapté à l’isotype pour contrôler la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. Les contrôles tissulaires positifs utilisant les mêmes protocoles IHC comprenaient la glande mammaire normale canine (anticorps anti-CK19, -ER, -CK14, -VIM, Alpha-SMA, -p63) et la peau canine (anti-CK5 / 6).

Le nombre de cellules positives par chaque marqueur a été calculé semi−quantitativement: -= pas de cellules colorées, ± = moins de 5% de cellules positives, += 5-50% de cellules positives, ++ = plus de 50% de cellules positives. Les cas ont été considérés comme positifs pour ER lorsqu’une coloration nucléaire a été observée dans au moins 5% des cellules tumorales.

3. Résultats

Quatre types de cellules myoépithéliales ont été reconnus sur la base de leur morphologie. Le sous-type au repos présentait les caractéristiques allongées des cellules fuselées en contact étroit avec les cellules épithéliales luminales ainsi que des cellules suprabasales proliférantes qui présentaient plutôt une forme polygonale (Figure 1(a)). Les cellules mobiles interstitielles ont été observées à la fois formant des nids (les nids lignés de type fuseau et les cellules étoilées constituaient le noyau du nid) et isolées dans l’interstitium (Figure 2(a)).

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Figure 1

Cellules myoépithéliales suprabasales: cellules au repos (flèches fines) et prolifératives (flèches épaisses). Expression immunohistochimique d’un panel d’anticorps appliqués par IHC, 63x (a) Hématoxyline-éosine; (b) anticorps anti-CK19 marquant le cytoplasme; (c) anticorps anti-ER marquant les noyaux; (d) anticorps anti-CK 5/6 marquant le cytoplasme; (e) anticorps anti-CK14 marquant le cytoplasme; (f) anticorps anti-VIM marquant le cytoplasme; (g) anticorps anti-Alpha-SMA marquant la membrane cytoplasmique; (h) anticorps anti-p63 marquant les noyaux.

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Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anticorps anti-VIM marquant le cytoplasme; (g) anticorps anti-Alpha-SMA marquant la membrane cytoplasmique; (h) anticorps anti-p63 marquant les noyaux.

3.1. Glande mammaire normale

Dans les 3 cas témoins, toutes les cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives ont été marquées par p63, CK14, Alpha-SMA et VIM. Les cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives n’ont exprimé CK19 dans aucun des cas.

3.2. Tissu mammaire de la Même lignée de la Tumeur mammaire

Dans les 29 tissus normaux de la même lignée que les tumeurs, toutes les cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives ont été marquées par p63, CK14, Alpha-SMA et VIM. CK5 / 6 était positif dans tous les cas sauf quatre et ER a été détecté dans 12 cas. L’expression de CK19 n’a été observée que dans l’épithélium luminal. Les cellules interstitielles mobiles myoépithéliales n’ont pas été observées. Tous les résultats sont résumés dans le tableau 2.

3.3. Tumeurs mammaires

Les résultats immunohistochimiques pour les cellules suprabasales (Figure 1) et mobiles (Figure 2) utilisant p63, CK14, CK5/ 6, CK19, Alpha-SMA, VIM et ER sont résumés dans le tableau 2. Marqué CK5 / 6: cellules au repos suprabasales dans 16 des 29 cas (5 carcinomes dans les tumeurs mixtes bénignes et 11 carcinomes complexes). CK 5/6 a également marqué les cellules prolifératives suprabasales et mobiles du fuseau dans 10 cas (3 carcinomes dans les tumeurs mixtes bénignes et 7 carcinomes complexes). Des cellules mobiles étoilées étaient présentes dans 25 cas (1 tumeur myoépithéliale bénigne, 3 tumeurs myoépithéliales malignes, 5 carcinomes dans les tumeurs mixtes bénignes et 15 carcinomes complexes) mais étaient négatives pour CK5/6. Le cartilage dans les tumeurs mixtes mammaires était toujours négatif.

CK14 a montré une positivité dans 23 cas dans des cellules au repos (à l’exception de 1 carcinome complexe et de tumeurs myoépithéliales bénignes et malignes), dans 22 cas dans des cellules prolifératives (6 carcinomes dans des tumeurs mixtes bénignes et 15 carcinomes complexes) avec une tendance à perdre l’expression lorsque ces cellules avaient acquis le phénotype plus mobile des cellules fuselées (positif dans 2 tumeurs myoépithéliales bénignes et 3 tumeurs myoépithéliales malignes, 2 carcinomes dans des tumeurs mixtes bénignes et 2 carcinomes complexes). Les chondrocytes de tumeurs mixtes étaient négatifs.

VIM était positif dans les cellules suprabasales dans les 23 cas de carcinome dans les tumeurs bénignes et les carcinomes complexes et dans les cellules myoépithéliales mobiles dans les 29 cas. Les cellules stromales étaient positives dans tous les cas. Le cartilage était VIM positif dans les 7 carcinomes des tumeurs mixtes bénignes.

Cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives marquées par l’alpha-SMA dans 23 carcinomes de tumeurs mixtes bénignes et de carcinomes complexes. Les cellules fuselées dans 10 cas (5 carcinomes dans une tumeur mixte bénigne et 5 carcinomes complexes) ont montré une positivité pour l’Alpha-SMA. Dans chaque cas, à l’exception de deux carcinomes complexes, les cellules étoilées étaient négatives. Le stroma a montré de la positivité dans seulement 6 cas (1 carcinome dans une tumeur mixte bénigne et 5 carcinomes complexes).

P63 a été détecté dans les cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives des 23 cas de carcinome dans une tumeur mixte bénigne et un carcinome complexe. Toutes les cellules mobiles fuselées et étoilées étaient négatives. Les cellules stromales et le cartilage étaient négatifs.

L’expression d’ER était présente dans 11 cellules myoépithéliales suprabasales (4 carcinomes dans les tumeurs mixtes bénignes et 7 carcinomes complexes); les cellules mobiles fuselées et étoilées étaient positives dans 9 cas (3 carcinomes dans des tumeurs mixtes bénignes et 6 carcinomes complexes). Le cartilage des tumeurs mixtes était négatif.

Les cellules myoépithéliales mobiles suprabasales et fuseau/stellaires au repos et prolifératives n’ont exprimé CK19 dans aucune des tumeurs examinées. Le cartilage des tumeurs mixtes était également négatif pour CK19.

4. Discussion

Basée sur les conclusions de Gama et al. et Tateyama et coll. , quatre types morphologiques de cellules myoépithéliales sont présents dans la glande mammaire: cellules myoépithéliales suprabasales au repos et prolifératives tapissant les alvéoles et les canaux et les cellules mobiles interstitielles fuselées et étoilées, qui se trouvent dans l’espace interstitiel où elles peuvent être disposées dans des nids. Les marqueurs myoépithéliaux, tels que p63, CK5 / 6, CK14, Alpha-SMA et VIM, se sont révélés être des adjuvants diagnostiques précieux pour faciliter l’évaluation des proliférations complexes et mixtes. CK19 est considéré comme le marqueur étalon-or de l’épithélium luminal et a été utilisé pour éviter tout diagnostic erroné avec les cellules myoépithéliales. En raison des schémas de réactivité croisée et du fait que les foyers lésionnels sont généralement minuscules, aucun des marqueurs myoépithéliaux n’a bénéficié d’une sensibilité et d’une spécificité à 100% pour les cellules myoépithéliales. En tant que tel, au moins 2 marqueurs doivent être utilisés pour évaluer un objectif donné.

D’après nos résultats, le meilleur marqueur pour les cellules suprabasales était p63, en particulier en association avec CK14, qui était limité aux cellules myoépithéliales matures (basales) et, dans une moindre mesure, suivi de CK5/6, Alpha-SMA et VIM (Figure 1). Cependant, CK5 / 6 a également marqué les cellules épithéliales luminales, ce qui rend difficile leur distinction avec les cellules myoépithéliales suprabasales prolifératives. Morphologiquement, les cellules épithéliales et myoépithéliales peuvent avoir une forme polygonale. Une caractéristique de CK14 et CK5/6, mais pas de p63, Alpha-SMA et VIM, était leur expression réduite dans les cellules myoépithéliales à l’état prolifératif suprabasal. L’expression de CK14, CK5/6 et p63 a été progressivement perdue dans les cellules à l’état mobile fuseau et stellaire.

Alpha-SMA et VIM étaient présents dans les cellules myoépithéliales mobiles du fuseau avec différents degrés d’intensité. Seul le VIM s’est avéré être un marqueur cohérent pour les cellules myoépithéliales mobiles étoilées. Dans cette étude, le myoépithélium mobile stellaire a été disposé dans des nids et tapissé de cellules au repos vraisemblablement d’origine alvéolaire. Cette caractéristique peut soutenir l’idée que les nids de cellules myoépithéliales mobiles étoilées, qui ont perdu l’expression des principaux marqueurs suprabasaux myoépithéliaux, mais ont conservé une affinité pour VIM, sont les précurseurs du cartilage, indiquant que ces cellules ont terminé leur transformation en éléments mésenchymateux. Dans les tumeurs myoépithéliales bénignes et malignes, le marquage VIM dans tous les cas, la perte de tous les autres marqueurs myoépithéliaux suprabasaux et la faible positivité à CK14 dans les cellules du fuseau indiquaient une expression dominante de l’état mobile du myoépithélium et un passage possible des cellules myoépithéliales simples aux fibroblastes mésenchymateux.

Dans notre étude, la preuve du passage des cellules myoépithéliales à un phénotype mésenchymateux, démontrée par la perte de l’expression de CK14, CK5 /6 et p63, a été renforcée par le marquage discontinu des cellules fuselées pour l’Alpha-SMA, un marqueur à la fois des cellules myoépithéliales et des myofibroblastes, qui a été complètement perdu dans les cellules mobiles étoilées censées devenir des fibroblastes.

D’autres études de confirmation par Tsuda et al. a signalé l’apparition de myofibroblastes avec des restes d’expression de CK14 (décrits comme des « cellules myoépithéliales converties »). Dans les cas examinés dans la présente étude, CK14 a progressivement disparu, indiquant donc une perte du phénotype (myo-)épithélial. Ces résultats soutiennent l’hypothèse EMT impliquant un état de type myoépithélial, qui subit une transition mésenchymateuse myoépithéliale (MMT). Cette hypothèse a été confirmée chez le chien par Gärtner et al. l’oms a déclaré que dans les tumeurs mammaires, l’une des étapes de l’évolution des cellules mésenchymateuses implique l’expression de traits myoépithéliaux typiques.

Un résultat intéressant de la présente étude a été la positivité à l’ER trouvée dans 12/29 cellules myoépithéliales suprabasales et 9/29 cellules étoilées de carcinome dans des tumeurs mixtes bénignes et des carcinomes complexes. Deux isoformes de récepteurs ER ont été décrites, à savoir ER-α et ER-β, cette dernière étant la seule forme exprimée dans les noyaux de cellules myoépithéliales basales isolées. L’anticorps utilisé dans la présente étude comprenait les deux isoformes: les cellules luminales et basales/étoilées ont été marquées, vraisemblablement les cellules luminales par ER-α et les cellules basales /étoilées par ER-β.

En conclusion, les cellules myoépithéliales suprabasales ont été bien caractérisées par p63 et CK14 et dans une moindre mesure par l’autre marqueur utilisé. Les cellules myoépithéliales mobiles sont plutôt caractérisées par l’Alpha-SMA et le VIM et la perte de CK14, CK5/6 et p63 (Figure 2). La présente étude a également démontré des ER dans les cellules myoépithéliales épithéliales luminales et suprabasales / étoilées (ces dernières dans environ la moitié des cas) et que l’expression des ER n’est pas influencée par la phase de repos / mobile. Par conséquent, dans les coupes en série ou à plusieurs chaînes, l’immunohistochimie à ER en combinaison avec p63 et CK14 peut servir à éviter une identification erronée des cellules luminales ou myoépithéliales dans les tumeurs mammaires canines. La tendance de l’expression préservée de l’Alpha-SMA et du VIM dans les cellules du fuseau, et seulement la positivité du VIM dans les cellules mobiles étoilées ainsi que la diminution de l’expression de p63 dans les deux types mobiles, corroborent l’hypothèse de l’EMT impliquant un état de type myoépithélial dans le MMT. La cellule mobile du fuseau pourrait être considérée comme une transformation plus précoce que la cellule étoilée vers un phénotype mésenchymateux.

Contribution des auteurs

Ces auteurs ont également contribué à ce travail.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêts concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient Mme Anne Collins d’avoir édité le texte en anglais.

Matériaux supplémentaires