Activation de la RNase H

La RNase H est une enzyme ubiquitaire qui dégrade le brin d’ARN d’un duplex ARN–ADN. Il a été identifié chez des organismes aussi divers que les virus et les cellules humaines (Crouch et Dirksen, 1985). Au moins deux classes de RNase H ont été identifiées dans les cellules eucaryotes. De multiples enzymes à activité RNase H ont été observées chez les procaryotes (Crouch et Dirksen, 1985). Bien que la RNase H soit impliquée dans la réplication de l’ADN, elle peut jouer d’autres rôles dans la cellule et se trouve dans le cytoplasme, ainsi que dans le noyau (Crum et al., 1988). Cependant, on pense que la concentration de l’enzyme dans le noyau est plus grande et une partie de l’enzyme présente dans les préparations cytoplasmiques peut être due à une fuite nucléaire.

Les éléments de reconnaissance précis de la RNase H ne sont pas connus. Cependant, il a été montré que des oligonucléotides aux propriétés similaires à celles de l’ADN, aussi courts que les tétramères, peuvent activer la RNase H (Donis-Keller, 1979). Les changements dans le sucre influencent l’activation de la RNase H en tant que modifications du sucre qui aboutissent à des oligonucléotides de type ARN, par exemple le 2′-fluoro ou le 2′-méthoxy ne semblent pas servir de substrats pour la RNase H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et coll., 1993). Des altérations de l’orientation du sucre par rapport à la base peuvent également affecter l’activation de la RNase H, car les α-oligonucléotides sont incapables d’induire la RNase H ou peuvent nécessiter un recuit parallèle (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). De plus, les modifications du squelette influencent la capacité des oligonucléotides à activer la RNase H. Les méthylphosphonates n’activent pas la RNase H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). En revanche, les phosphorothioates sont d’excellents substrats (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et coll., 1991; Stein et Cheng, 1993). De plus, des molécules chimériques ont été étudiées sous forme d’oligonucléotides qui se lient à l’ARN et activent la RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et coll., 1989). Par exemple, les oligonucléotides constitués d’ailes de 2′-méthoxy phosphonates et d’un gap à cinq bases de désoxyoligonucléotides se lient à leur ARN cible et activent la RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et coll., 1989). De plus, un ribonucléotide unique dans une séquence de désoxyribonucléotides s’est avéré suffisant pour servir de substrat à la RNase H lorsqu’elle est liée à son désoxy-oligonucléotide complémentaire (Eder et Walder, 1991).

Il a également été démontré qu’il est possible de tirer parti des oligonucléotides chimériques conçus pour activer la RNase H et avoir une plus grande affinité pour leurs récepteurs à ARN et pour améliorer la spécificité (Giles et Tidd, 1992; Monia et al., 1993). Dans une étude, le clivage du transcrit cible médié par la RNase H était beaucoup plus sélectif lorsque les désoxyoligonucléotides composés d’ailes de désoxyoligonucléotides de méthylphosphonate et de lacunes de phosphodiester étaient comparés à des oligonucléotides de phosphodiester complets (Giles et Tidd, 1992).

Malgré les informations sur la RNase H et la démonstration que de nombreux oligonucléotides peuvent activer la RNase H dans des dosages de lysat et d’enzymes purifiées, on en sait encore relativement peu sur le rôle des caractéristiques structurelles des cibles d’ARN dans l’activation de la RNase H (Minshull et Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder et Walder, 1988). En fait, la preuve directe que l’activation de la RNase H est en fait le mécanisme d’action des oligonucléotides dans les cellules a, jusqu’à très récemment, fait défaut.

Des études récentes dans nos laboratoires fournissent des informations supplémentaires, quoique indirectes, sur ces questions. ISIS 1939 est un phosphorothioate de 20 mer complémentaire d’une séquence dans la région 3′-non traduite de l’ARN ICAM-1 (Chiang et al., 1991). Il inhibe la production d’ICAM dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine et les taches nordiques démontrent que l’ARNm de l’ICAM-1 est rapidement dégradé. Un analogue 2′-méthoxy d’ISIS 1939 présente une affinité plus élevée pour l’ARN que le phosphorothioate, est stable dans les cellules, mais inhibe beaucoup moins la production de protéines ICAM-1 que ISIS 1939. Il est probable que ISIS 1939 déstabilise l’ARN et active la RNase H. En revanche, ISIS 1570, un phosphorothioate 18-mer qui est complémentaire du codon d’initiation de la traduction du message ICAM-1 a inhibé la production de la protéine, mais n’a provoqué aucune dégradation de l’ARN. Ainsi, deux oligonucléotides capables d’activer la RNase H ont eu des effets différents selon le site de l’ARNm auquel ils se sont liés (Chiang et al., 1991). Une démonstration plus directe que la RNase H est probablement un facteur clé de l’activité de nombreux oligonucléotides antisens a été fournie par des études dans lesquelles la PCR par ligature inverse a été utilisée pour identifier les produits de clivage de l’ARNm du bcrabl dans des cellules traitées avec des oligonucléotides de phosphorothioate (Crooke et al., 1995).

Compte tenu du rôle émergent des oligonucléotides chimériques avec des modifications des ailes 3′ et 5′ conçues pour améliorer l’affinité pour la stabilité de l’ARN cible et de la nucléase et un écart de type ADN pour servir de substrat à la RNase H, les études axées sur la compréhension des effets de diverses modifications sur l’efficacité de la ou des enzymes sont également d’une importance considérable. Dans une de ces études sur la RNase H d’E. coli, nous avons signalé que l’enzyme présente une spécificité de séquence minimale et est processive. Lorsqu’un oligonucléotide chimérique avec des sucres modifiés en 2′ dans les ailes a été hybridé à l’ARN, le site initial de clivage était le nucléotide adjacent à la jonction méthoxy-désoxy la plus proche de l’extrémité 3′ du substrat d’ARN. Le taux initial de clivage a augmenté à mesure que la taille de l’écart d’ADN augmentait et que l’efficacité de l’enzyme était considérablement moindre contre une cible d’ARN duplexée avec un oligonucléotide antisens chimérique qu’un oligonucléotide de type ADN complet (Crooke et al., 1995).

Dans des études ultérieures, nous avons évalué plus en détail les interactions des oligonucléotides antisens avec des cibles structurées et non structurées, et les impacts de ces interactions sur la RNase H (Lima et Crooke, 1997). En utilisant une série de substrats non clivables et des analyses de Michaelis-Menten, nous avons pu évaluer à la fois la liaison et le clivage. Nous avons montré qu’en fait, la RNase H1 d’E. coli est une protéine de liaison à l’ARN double brin. Le Kd pour le duplex d’ARN était de 1,6 µM ; le Kd pour un duplex d’ADN était de 176 µM ; et le Kd pour l’ADN simple brin était de 942 µM. En revanche, l’enzyme ne pouvait cliver l’ARN que dans un duplex ARN-ADN. Toute modification de 2′ dans le médicament antisens au site de clivage a inhibé le clivage, mais une réduction significative de la charge et des modifications de 2′ ont été tolérées au site de liaison. Enfin, le fait de placer une charge positive (par exemple, la 2′-propoxyamine) dans le médicament antisens a réduit l’affinité et le clivage. Nous avons également examiné les effets des structures d’ARN induites par des oligonucléotides antisens sur l’activité de la RNase H1 d’E. coli (Lima et Crooke, 1997). On a constaté que toute structure dans le substrat duplex avait un effet négatif significatif sur le taux de clivage. De plus, le clivage de sites sélectionnés a été entièrement inhibé, ce qui s’explique par un obstacle stérique imposé par la boucle d’ARN traversant soit les rainures mineures ou majeures, soit l’hétéroduplex. Récemment, nous avons cloné et exprimé la RNase H1 humaine. La protéine est homologue de la RNase H1 d’E. coli, mais possède des propriétés similaires à celles décrites pour la RNase H humaine de type 2 (Frank et al., 1994; Wu et coll., 1998). L’enzyme est stimulée par de faibles concentrations de Mg2+, inhibée par des concentrations plus élevées et est inhibée par Mn2 + en présence de Mg2+. Son poids moléculaire est de 33 kDa. Il s’agit d’une protéine de liaison à l’ARN double brin et présente des préférences de position et de séquence uniques pour le clivage (Wu et al., 1999). De plus, la RNase H2 humaine a été clonée, mais à ce jour, il n’a pas été démontré que la protéine exprimée soit active (Frank et al., 1998). Très récemment, nous avons rapporté les effets de plusieurs mutations introduites dans la RNase H1 humaine sur l’activité de l’enzyme (Wu et al., 2000). Ainsi, nous disposons maintenant des outils nécessaires pour commencer à explorer les rôles de la RNase H humaine dans les processus biologiques et pharmacologiques et à commencer à développer des médicaments conçus pour interagir avec eux plus efficacement.

Enfin, au moins en ce qui concerne la dégradation induite par la RNase H de l’ARN ciblé, nous avons récemment démontré que de l’ordre de 1 à 150 copies d’ARN par cellule, le niveau d’ARN cible n’a aucun effet sur la puissance des inhibiteurs antisens (Miraglia, 2000). Cela est dû au fait que le nombre de molécules de médicament antisens par cellule dépasse le nombre de copies d’ARN de plusieurs ordres de grandeur. Ainsi, d’autres facteurs doivent limiter le débit.