Lott a été sélectionné au premier tour (8e au total) de la Draft 1981 de la NFL par les 49ers de San Francisco. Le niveau d’habileté démontré par le joueur vedette de 6 pieds et 203 livres a été immédiatement reconnu et, dès le début du camp d’entraînement, il a occupé le poste de demi de coin gauche partant des 49ers. Lors de sa saison recrue en 1981, il enregistre sept interceptions, aide les 49ers à remporter le Super Bowl XVI et devient également la deuxième recrue de l’histoire de la NFL à retourner trois interceptions pour des touchdowns. Son jeu exceptionnel lui a permis de terminer deuxième pour les honneurs de recrue de l’année, derrière le secondeur des Giants de New York Lawrence Taylor.

Lott est passé à la position de sécurité en 1985. Il a eu le bout de son petit doigt gauche amputé après la saison 1985 lorsqu’il a été écrasé alors qu’il s’attaquait au running back Timmy Newsome, et une chirurgie de greffe osseuse ne lui aurait pas permis de commencer la saison 1986. Une blessure l’a mis à l’écart pour les deux derniers matchs de la saison en 1986, mais il a tout de même mené la ligue avec 10 interceptions, tout en enregistrant 77 tacles, trois fumbles forcés et deux sacs du quart. En 10 ans avec les 49ers, Lott les a aidés à remporter huit titres de division et quatre Super Bowls : XVI (saison 1981), XIX (1984), XXIII (1988) et XXIV (1989). Il est l’un des cinq joueurs qui ont participé aux quatre victoires des 49ers au Super Bowl des années 1980. Les quatre autres sont le quart-arrière Joe Montana, le secondeur Keena Turner, le demi de coin Eric Wright et le receveur Mike Wilson.

Après sa carrière à San Francisco, Lott signe comme agent libre en 1991 avec les Raiders de Los Angeles et en 1993 avec les Jets de New York. En 1991, il mène la ligue pour les interceptions (8) pour une deuxième fois. Lott signe un contrat d’agent libre avec les Chiefs de Kansas City en 1995, mais se blesse lors de la pré-saison. Il retourne chez les 49ers en 1995, mais les blessures qu’il avait subies au cours des quatre saisons précédentes continuent de le tourmenter, et il annonce sa retraite avant le début de la saison. Il a été élu au Temple de la renommée du football professionnel en 2000, sa première année d’éligibilité, et a également été nommé dans l’équipe du 75e anniversaire de la NFL en 1994 et dans l’équipe du 100e Anniversaire en 2019.

Au cours de ses 14 saisons en NFL, Lott enregistre 8,5 sacks et 63 interceptions, qu’il retourne pour 730 yards et cinq touchdowns. Il a récupéré 17 fumbles, les a retournés pour 43 verges et a gagné 113 verges sur les retours de botté. Lott a également participé à 20 matchs d’après-saison, enregistrant neuf interceptions, 89 tacles, un fumble forcé, une récupération de fumble et deux touchdowns. De plus, il a été nommé All-Pro huit fois, All-NFC six fois et All-AFC une fois. Au-delà des statistiques, Lott avait une conscience étrange de la façon dont un jeu se développait, ce qui lui a permis de briser des passes et de gagner une réputation comme l’un des plaqueurs en plein champ les plus durs et les plus efficaces de l’histoire de la ligue.