Une méthode très efficace de transfert de gènes dans les cellules de mammifères consiste à l’infection par des vecteurs rétroviraux. L’efficacité de l’infection rétrovirale est considérablement améliorée, de 100 à 1 000 fois dans certaines cellules, en incluant le polybrène pendant l’infection. Le polybrène avec un choc DMSO est également utilisé pour médier le transfert d’ADN dans une variété de types cellulaires, tels que le CHO, les fibroblastes d’embryons de poulet, le NINH-3T3 et les cellules myéloïdes.
Protocole: Infection rétrovirale
Les stocks de rétroviraux recombinants sont préparés en ajoutant 5 ml de milieu de croissance avec 5% de sérum à une monocouche quasi confluente de cellules de conditionnement rétrovirales transfectées dans une plaque de 100 mm. Après 24 heures, le milieu est retiré et filtré à travers un filtre de 0,45 um.
Les cellules devant être infectées par ce stock rétroviral recombinant sont plaquées à 500 000 cellules par plaque de 100 mm dans 10 ml de milieu complet.
24 heures plus tard, retirer le milieu de croissance des cellules. Infecter les cellules avec 2 ml du surnageant viral (ou une dilution du stock viral en 2 ml) en présence de 5 à 10 mg de polybrène par ml (concentration finale). Incuber les cellules pendant 3 à 6 heures à 37°C.
Ajouter 8 ml de milieu complet. Trois jours après l’infection, divisez les cellules 1: 5 en milieu de sélection.

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Protocole : Transfection
de cellules en plaques à environ 50% de confluence dans un milieu de croissance complet.
18 à 24 heures après le placage, préparer la solution d’ADN-Milieu-Polybrène, immédiatement avant l’utilisation comme suit:
Remarque: Chaque composant doit être ajouté dans l’ordre approprié.
1er : Milieu de croissance complet (2 ml pour une plaque de 60 mm et 3 ml pour une plaque de 100 mm) chauffé à 37°C.
2ème : ADN plasmidique, 10ng à 10ug. Mélanger doucement.
3ème: Polybrène à une concentration finale de 5ug à 10ug par ml. Mélanger délicatement
Retirer le milieu de la plaque et ajouter une solution d’ADN-Milieu-Polybrène aux cellules. Incuber les cellules à 37 °C pendant 6 à 20 heures avec un léger balancement occasionnel environ tous les 1.5 heures pour les 6 premières heures.
Retirez la solution d’ADN-Milieu-Polybrène et recouvrez doucement les cellules avec une solution de choc DMSO (15% de DMSO dans 1X HBSS: Specialty Media catalog #S-051-D) 3 ml par boîte de 60 mm et 4 ml par plaque de 100 mm. Basculez manuellement le plat pendant 10 secondes pour répartir uniformément la solution, puis incubez les cellules pendant exactement 4 minutes à 37 ° C.
Retirez immédiatement la solution de choc DMSO et rincez doucement les cellules deux fois avec du milieu de croissance complet, 5 ml par lavage par plat de 60 mm, 10 ml par lavage par plat de 100 mm
Ajoutez du milieu de croissance complet aux cellules.
Pour les transformants stables, retirez le milieu de croissance et divisez les cellules 1:5 en milieu de sélection.
Pour une expression transitoire, retirer le milieu de croissance et ajouter du milieu de croissance frais. Récolter les cellules et/ou le milieu après 24 à 72 heures.

Chaney, W.G. et coll., 1986. Génétique cellulaire et moléculaire Somatique. Vol. 12, n° 23,
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Chisholm, O. et al., 1998. Recherche sur les acides nucléiques. Vol. Le réactif 16, No 5, 2352
est fourni filtré à travers des membranes de 0,2 um et hydraté avec du H20 stérile.