Résultats

Nous avons étudié des souris de type sauvage (POIDS), hétérozygotes V2RV31R/POIDS et homozygotes V2R31R/V2R31R. Les souris mutantes avaient des nombres et des fréquences normaux de cellules T αβ spléniques matures et de thymocytes à chaque stade de développement. En raison de l’absence de marqueurs congénitaux, les protéines TCRß ne peuvent pas être identifiées par l’allèle qui les code, ni si elles incluent des régions Cß1 versus Cß2. Ainsi, nous avons réalisé une cytométrie en flux à l’aide d’anticorps anti-V2 et anti-V31 pour quantifier les cellules exprimant les protéines TCRß V2+ et V31+. Nous avons dosé les thymocytes mono-positifs (SP) CD4+ et CD8+ car ce sont des cellules T αβ matures et naïves. En tenant compte des données publiées (8, 9), nous avons détecté une petite fraction (0,11%) de cellules colorées avec les deux anticorps chez des souris en poids (Fig. 1 B et C), ce qui est cohérent avec une petite population de lymphocytes T αβ V2 + V31+. Nous avons observé une fraction de ces cellules multipliée par 12,4 chez les souris V2R31R/WT et une augmentation de 32,8 chez les souris V2R31R/V2R31R (Fig. 1 B et C). Ces fréquences élevées des cellules dual-TCRß+ correspondaient aux utilisations plus importantes de V2 et V31 dans les chaînes TCRß exprimées (Fig. 1 D-F). Ces données démontrent que l’amélioration de la qualité RSS de deux Vß sur le même allèle augmente leur réarrangement et par conséquent la fraction de lymphocytes T exprimant deux types distincts de protéines TCRß. Comme le répertoire Vß des thymocytes SP reflète les niveaux relatifs de recombinaison des segments Vß individuels (10), l’utilisation préférentielle de V31 par rapport à V2 révèle que V31R surpasse V2R pour le réarrangement. Cela pourrait être dû à une plus grande accessibilité de V31 (11) ou à l’interaction de V31 avec des segments Dß–Jß avant que la contraction du locus TCRß place V2 près des segments Dß–Jß. Notamment, l’augmentation plus de deux fois supérieure de ces cellules dual-TCRß+ chez les souris V2R31R/V2R31R par rapport aux souris V2R31R/WT implique que deux réarrangements V(D)Jß distincts peuvent contribuer à l’expression de TCRß à partir du même allèle.

Pour déterminer si un seul allèle TCRß peut effectivement supporter l’expression de protéines TCRß à partir de deux réarrangements V(D)Jß différents, nous avons analysé des souris où un allèle TCRß est inactivé par délétion de l’activateur TCRß (Eß) (12, 13). Nous avons dosé des souris portant l’allèle délété Eß en face d’un allèle WT, un allèle avec un remplacement RSS de V2 (V2R) ou de V31 (V31R), ou des deux (8). Nous avons détecté un faible pourcentage (0,094%) de thymocytes V2+ V31+ SP chez des souris WT/EβΔ (Fig. 2 A et B), représentant potentiellement une population rare de cellules exprimant deux protéines TCRß différentes à partir du même allèle WT. Quoi qu’il en soit, nous avons observé des cellules V2+ V31+ à une fréquence 1,9 fois plus grande chez les souris V2R/EβΔ et à une fréquence 4,8 fois plus grande chez les souris V31R/EβΔ (Fig. 2 A et B). Ainsi, l’amélioration de la qualité de l’un ou l’autre des RSS Vß élève la fraction de cellules exprimant à la fois les protéines TCRß V2+ et V31+. Notamment, nous avons détecté une fréquence multipliée par 14,4 des cellules V2+V31+ chez les souris V2RV31R/EβΔ par rapport aux souris WT/EβΔ (Fig. 2 A et B), indiquant que l’amélioration de la qualité de deux RSS Vß augmente de manière synergique le pourcentage de cellules exprimant à la fois les protéines TCRß V2+ et V31+. En effet, la suppression d’une partie du RSS V31 sur l’allèle V2R (l’allèle V2R31Δ ; Fig. 2C) réduit considérablement la fréquence des cellules V2+ V31+ à des niveaux équivalents ou inférieurs à ceux des souris V2R/EβΔ (0,178% versus 0,135%; Fig. 2 A et B). Collectivement, ces données confirment que l’allèle V2R31R favorise l’expression de deux protéines TCRß distinctes à partir de deux réarrangements V(D)Jß différents sur un seul allèle.

Notre étude démontre qu’un mécanisme génétique intrinsèque régit l’assemblage et l’expression de TCRß monogène. Nous montrons que les RSS Vß de mauvaise qualité coopèrent pour limiter l’assemblage et l’expression de deux gènes TCRß distincts d’un allèle. Nous avons précédemment montré que des RSS Vß de mauvaise qualité restreignent stochastiquement la fréquence de recombinaison Vß avant l’inhibition de la rétroaction pour diminuer l’assemblage biallélique et l’expression des gènes TCRß (8). Nous concluons maintenant que les RSSV Vß de faible qualité réduisent également l’incidence de la recombinaison de V31 et d’un Vß en amont sur le même allèle. Ces réarrangements pourraient impliquer soit 1) un réarrangement délétionnel V2 vers le groupe Dß1–Jß1–Cß1 et un réarrangement inversionel V31 vers le groupe Dß2–Jß2–Cß2, soit 2) un réarrangement inversionel V31 vers le groupe Dß1–Jß1–Cß1, qui inverse une partie du locus qui contient le groupe Dß2–Jß2–Cß2, puis un réarrangement inversionel V2 vers le groupe Dß1–Jß1–Cß1, qui inverse une partie du locus qui contient le groupe Dß2-Jß2-Cß2, puis un réarrangement inversionel V2 vers le groupe Cluster Dß2-Jß2-Cß2 (7) (Fig. 2D). Pour obtenir l’assemblage et l’expression de TCRß monogéniques, ce mécanisme génétique basé sur le RSS pourrait fonctionner avec des processus épigénétiques impliqués dans l’application de la recombinaison Vß monoallélique. Par exemple, il a été proposé que les interactions dynamiques des segments Vß avec la lame nucléaire abaissent l’efficacité de recombinaison Vß en réprimant l’accessibilité de la chromatine Vß et le bouclage chromosomique entre les amas Dß–Jß et les segments Vß en amont (14, 15). Dans ce contexte, des RSSV Vß de mauvaise qualité pourraient réduire la probabilité que deux réarrangements Vß se produisent sur un allèle lorsque V31 et un segment Vß amont sont tous deux accessibles et que le Vß amont est bouclé à proximité des segments Dß-Jß. Ainsi, les propriétés des RSSs peuvent sous-tendre l’assemblage et l’expression monogéniques des protéines TCRRY, TCRδ et Igλ chez les mammifères et des protéines Ig chez les poissons cartilagineux. De plus, V RSSs peut également contribuer à l’exclusion isotypique Igk et Igλ dans les cellules B.