extracelluláris mátrix előkészítés és reológia

az ECM zselatin és fibrin hálózatból áll. Az ECM komponensek elkészítéséhez először 15 tömeg/v% – os zselatinoldatot (a típus, 300 bloom sertésbőrből, Sigma) állítanak elő zselatinpor hozzáadásával egy meleg oldathoz (70 Kb C) DPBS (1x dulbelco foszfátpufferelt sóoldata kalcium és magnézium nélkül). A zselatint hagyjuk teljesen feloldódni 12 órán át 70 6CC-on történő keverés közben, majd a pH-t 7,5-re állítjuk 1 m NaOH alkalmazásával. Az oldatot sterilen leszűrjük, és 4 6CC-n alikvotokban tároljuk későbbi öntési felhasználás céljából (<3 hónap). Fibrinogén oldatot (50 mg/mL) úgy állítanak elő, hogy liofilizált szarvasmarha vérplazma fehérjét (Millipórust) 37 ft-on steril DPB-kben, kalcium és magnézium nélkül oldanak fel. Az oldatot 37 6CC-on tartjuk keverés nélkül legalább 45 percig, hogy lehetővé tegyük a teljes oldódást. A transzglutamináz (TG) oldatot (60 mg/mL) úgy állítjuk elő, hogy liofilizált port (Moo Gloo) oldunk DPB-kben kalcium és magnézium nélkül, majd 20 másodpercig óvatosan keverjük. az oldatot ezután 37 60 percig tartjuk, majd sterilen szűrjük használat előtt. A CaCl2 törzsoldatot (250 mM) úgy állítják elő, hogy a CaCl2 Port DPB-kben kalcium és magnézium nélkül feloldják (Corning). A trombin törzsoldatának elkészítéséhez a liofilizált trombint (Sigma Aldrich) 500 egység/mL-en, steril DPB-k alkalmazásával kell feloldani, és -20 ft-on kell tárolni.

a tinta reológiai méréséhez egy 40 mm átmérőjű, 2 db-os kúp-és lemezgeometriájú szabályozott feszültség reométert (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) használnak. A nyírástároló (g’) és a veszteség (G”) modulust 1 Hz frekvencián és 0,01 oszcillációs feszültséggel mérjük. Az idősöprést úgy végezzük, hogy egy előkeverett ECM oldatot, amely trombint tartalmaz, gyorsan felhelyezünk a Peltier lemezre, amelyet 37 Kb-nál tartunk.

Tinta készítmények

két tinta szükséges a perfumálható PT modellek 3D bioprinteléséhez. Az egyik tinta, amelyet a perfúziós chip tömítés létrehozására használnak, egy kétrészes szilikon elasztomerből (SE 1700, DOW Chemical) áll, 10:1 bázissal a katalizátorhoz (tömeg szerint), amelyet centrifugális keverővel homogenizálnak 2 percig (2000 fordulat / perc, ae-310, Thinky Corp, Japán). A szilikon tintát a katalizátorral való keverés után 2 órán belül nyomtatják. Ez a tinta fecskendőbe van töltve (EFD Inc., East Providence, RI), és szobahőmérsékleten történő nyomtatás előtt centrifugálják, hogy eltávolítsák a légbuborékokat. A másik tinta, a tubulus nyomtatásához használt diffúz tinta 38 tömeg% Pluronikus F127 (Sigma) és 100 U/mL trombinból áll ionmentesített, ultraszűrt (DIUF) vízben. A szökevény tintát rózsaszínűre festik egy kockázati Reaktorfesték hozzáadásával az ábrán látható megjelenítéshez. 1 és film S1. A tinta elkészítéséhez egy 40 tömeg% – os Pluronic F127 oldatot vízben egy Thinky mixer segítségével homogenizálunk, amíg a por teljesen fel nem oldódik, majd ezt követően 4 6CC-n tároljuk.használat előtt 2000 U/mL trombin oldatot adunk a diffúz (Pluronic) tintához 1:20 arányban, majd egy Thinky mixer segítségével homogenizáljuk. A szökevény tintát ezután egy fecskendőbe töltik (EFD Inc., East Providence, RI) 4 (c) órakor, és centrifugálják, hogy eltávolítsák a légbuborékokat. Nyomtatás előtt ezt a tintát szobahőmérsékleten legalább 15 percig egyensúlyba hozzuk.

perfusable 3D proximális tubulus konstrukciók Bioprintelése

a 3D PT konstrukciók egyedi tervezésű, multimateriális 3D bioprinterrel készülnek, amely négy, egymástól függetlenül címezhető nyomtatófejjel van felszerelve egy 3 tengelyes, mozgásvezérelt portálra, 725 mm 650 mm 625 mm beépítési térfogattal (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). A tinták külön fecskendőhordókban vannak elhelyezve, amelyekhez különböző méretű (azaz 50 6-4 10 XNUMX mm átmérőjű) fúvókák vannak rögzítve luer-lock (EFD Inc., Kelet-Providence, RI, USA). A tintákat a lerakódási fúvókákon keresztül extrudálják Légnyomás alkalmazásával (800 Ultra adagoló rendszer, EFD Inc., East Providence, RI, USA), kezdve a 10-90 psi, megfelelő nyomtatási sebesség között 1 mm/s és 5 cm/s. először nyomtassa ki a személyre szabott perfúziós chip tömítés letétbe a szilikon tinta egy kúpos 410 db fúvókát rá 50 mm-es 75 mm-es üveg diák. A tömítés kialakítása egy egyedi Matlab szkript segítségével jön létre, amely G-kódot generál a végső tömítőszerkezethez. Nyomtatás után a perfúziós chip tömítést 80 6c hőmérsékleten kikeményítjük egy >1 h kemencében, majd használat előtt szobahőmérsékleten tároljuk.

a perfúziós chipen belüli 3D PTs Mintázásához az ECM öntése és a szökevény tinta nyomtatása szükséges. Először az ECM oldatot 10 mg/mL fibrinogén, 7,5 tömeg% zselatin, 2,5 mM CaCl2 és 0,2 tömeg% TG kombinálásával állítják elő. Ezt az oldatot ezután 37 Kb-on egyensúlyba hozzuk 15-20 percig használat előtt az ecm25 optikai tisztaságának javítása érdekében. Ezután az oldatot gyorsan összekeverjük a trombinnal 500:1 arányban, ami 1 U/mL végső trombinkoncentrációt eredményez. 2 percen belül 37cc-nél a fibrinogén polimerizációja fibrin gélré alakul. Ezért az ECM oldatot a trombinnal való keverés után azonnal a perfúziós chip alapjára kell önteni. Az alap ECM réteget ezután hagyjuk kissé megszáradni nitrogén alatt, úgy, hogy sík felületet képezzen. A szökevény Pluronikus F127 tintát (100 U/mL trombinnal) az alap ECM rétegre tekervényes film (tubulus) formájában nyomtatjuk egy kúpos 200 MHz-es fúvóka segítségével. Egy egyedi Python szkriptet (MeCode) használnak az eszközút meghatározásához a G-kódban. Közvetlenül a szökevény tinta nyomtatása után a szilikon tömítésen keresztül összekapcsolt fém üreges perfúziós csapok érintkeznek a nyomtatott tintával. Az ECM felső rétegét ezután úgy alakítjuk ki, hogy az ECM oldatot a fent leírt módon a nyomtatott tubulusra öntjük a tömítésfalak magasságától számított 1-2 mm-en belül. Ha a sejtek, például a Hndf-ek beépülnek az ECM-be (ábra. S5), közvetlenül az egyensúlyi periódus után, a trombin keverése és az azt követő öntés előtt keverik be. A felső ECM réteg öntése után a szerkezetet üveglemez borítja, hogy megakadályozza a párolgást vagy a szennyeződést, és 37 6CC-on 1 órán át tartja, hogy lehetővé tegye a fibrin polimerizáció befejeződését és a TG-t a hálózat térhálósodásához. A konstrukciót ezután 4 db C-ra hűtjük 15-20 percig, hogy cseppfolyósítsuk a nyomtatott szökevény tintát, amelyet hideg cellás közeg segítségével kiöblítünk az eszközből, olyan nyitott vezetékeket hagyva hátra, amelyek az ECM-be ágyazott kívánt csőhálózatként szolgálnak az extratubuláris ECM térben lévő cellákkal vagy anélkül.

ezzel a módszerrel 3D architektúrákat is készítettünk rétegenként felépítési sorrendben. Például, minden egyes réteg a háromrétegű szerkezet ábrán látható. Az S10 egy módosított nyomtatási protokoll használatával készült, amely magában foglalja a korábban tárgyalt anyagokat és módszereket. Miután az első tubulusokat diffúz tintával nyomtatták, egy ECM réteget öntünk a nyomtatásra, és hagyjuk 20 percig gélesedni 37 Kb-nál, mielőtt a következő proximális tubulusréteget diffúz tintával nyomtatnánk a nemrégiben gélesített réteg tetejére. Ez az egymást követő konstrukció bevezeti a 3D geometriát, és lehetővé teszi az összes csatorna sikeres kiürítését függetlenül az építés után. A vizes alapú kockázati reaktor színezékeket a csatornákon keresztül perfundálják, és UV-fénnyel gerjesztik a vizualizáció érdekében.

a 3D tissue chip összeszerelési folyamat befejezéséhez minden PT konstrukciót egy megmunkált rozsdamentes acél alapra, a tetejére pedig vastag akril fedelet helyeznek. A fedelet és az alapot négy csavar rögzíti össze, amely tömítést képez a nyomtatott szilikon tömítés körül. Ezután a steril kétállású perisztaltikus csövet (PharMed BPT, 0,25 mm belső átmérő) médiummal töltjük meg, és egy steril szűrő kimenetéhez csatlakoztatjuk, amely egy 10 ml-es fecskendőhordóhoz (EFD Nordson) van csatlakoztatva, amely média tartályként szolgál. PTEC média (tervezett növekedés, így ATCC készítmény plusz 1% FBS, 1% aprotinin, és 1% anti-anti), hogy már equilibrating a >3 h egy inkubátorban a 37 C, 5% CO2 adunk a Média tartály, és a cső a tartály csatlakozik a kimenet a chip (fém üreges perfúziós csap). Ezután egy fecskendőt használnak, hogy enyhe nyomást gyakoroljanak a hordóban lévő közegre, arra kényszerítve, hogy belépjen és teljesen kitöltse a mellékelt csövet. A cső közeggel való feltöltése az áramkörhöz való csatlakozás előtt megakadályozza a légbuborékok bejutását a rendszerbe. A perfúziós áramkör befejezéséhez a tartályból származó szilikon cső csatlakozik a chip bemeneti fém perfúziós csapjához. A perfúziós chip bemeneti és kimeneti nyílásánál tömlőcsípő bilincseket adnak hozzá, hogy megakadályozzák az ellenőrizetlen áramlást, amikor leválasztják a perisztaltikus szivattyút, ami károsíthatja a hámot, vagy lehetővé teszi a légbuborékok bejutását a rendszerbe. A közegtartály a közegtartály tetején elhelyezett steril szűrő segítségével az inkubátorban mindenkor egyensúlyba kerül a légköri viszonyokkal.

sejttenyészet

az emberi halhatatlanná vált Ptec-ket (RPTEC/TERT1, ATCC CRL-4031) az ATCC utasításai szerint tenyésztik, és minden PT modellvizsgálathoz használják a 20.szakaszig. A génexpresszió elemzéséhez humán primer rptec (Cell Science), immortalizált Ptec (RPTEC-TERT1, Evercyte) és a498 (ATCC HTB-44) veserák sejteket használnak és tenyésztenek a szállító utasításai szerint. Humán újszülött dermális fibroblasztok (HNDF), GFP expresszáló (Angio-Proteomie) tenyésztjük egy szállító utasításait, és használják fel a folyosón 15.

génexpressziós analízis

humán primer RPTEC (Cell Science), immortalizált RPTEC-TERT1 (Evercyte) és A498 (ATCC HTB-44) veserák sejteket 96 lyukú lemezeken tenyésztjük a szállító utasításai szerint, és a 3.napon összegyűjtjük az összefolyást követően, a táptalajt 100 db 6x RNS lízis keverékkel helyettesítve (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101). Ezután 40 ml lizátumot összekeverünk egy mRNS-elfogó mágneses gyöngykészlettel (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, katalógusszám 312631), egy éjszakán át inkubáljuk, elágazó DNS-amplifikáció céljából feldolgozzuk, és a gyártó utasításai szerint elemezzük (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). A PPIB szondát háztartási génként használják a normalizáláshoz. A fluoreszcencia intenzitás (Fi) adatait 3 biológiai replikáció átlagaként és szórásaként mutatjuk be.

a Média-perfúzió citokin analízise

a Média-perfúziót egy tubulusból gyűjtjük a sejtvetést követő 25 napon keresztül, és az analízist megelőzően -80 C-on tároljuk. A citokin profilozáshoz a felülúszókat jégen felolvasztják, 2x-szer hígítják a minta hígító pufferében (BioRad katalógus #M60-009RDPD), és Luminex technológián alapuló ELISA-val elemzik a Bio-Plex Pro humán kemokin IL-6 (készlet #171bk29mr2), IL-8 (készlet #171-BK31MR2) és MCP-1 (készlet #171-BK36MR2) és a Bio-Plex segítségével 200 rendszer (biorad) a gyártó utasításai szerint. Az adatokat átlagos citokinkoncentrációként és a technikai triplikátumok szórásaként jelentik.

epithelializáció és longitudinális tenyésztés

minden 3D PT konstrukciót több órán át perfundálnak PTEC közeggel az inkubátorban a sejt betöltése/vetése előtt. A ptec-eket (PTEC/TERT1, ATCC) a tenyészedényből tripszinizálják, és a táptalajban ~2 607 sejt/mL-re koncentrálják. A sejtszuszpenziót ezután a kimeneten keresztül a perfúziós chipbe töltik (ábra. S3b, c). A betöltött konstrukciót oldalirányban az inkubátorba helyezzük néhány órára, és több félórás időközönként 180-at megfordítjuk, hogy lehetővé tegyük a tubulus falainak egyenletes vetését, majd egy éjszakán át áramlás nélkül inkubáljuk a tubulusban. Másnap a nem tapadó sejteket gravitáció útján kiöblítik a tubulusból. Ezután megkezdődik a friss táptalaj perfúziója, a fennmaradó sejtek klaszterezni kezdenek, majd ezekből a kolóniákból nőnek ki (ábra. S3f), amíg a vetés után körülbelül 3 héttel el nem érik az összefolyást (ábra. S3k). A növekedési szakaszban a Ptec-ket az ATCC irányelvei szerint előállított PTEC táptalajjal, plusz 1% aprotininnal (EMD Millipore, az ECM lebomlásának lassítására használják), 1% magzati szarvasmarha szérummal (FBS) és 1% antibiotikum-antimikotikummal (Gibco) táplálják. Az érés után az FBS-t eltávolítják, és a PTECs-eket egy szűk epitheliális egyrétegbe csomagolják (Movie S2). Az 1.napon a vetés után a Ptec-ek folyamatos, egyirányú áramlásnak vannak kitéve 1 db/perc sebességgel, ami a tubulus keresztmetszetétől függően 0,1-0,5 din/cm2 közötti nyírófeszültségnek felel meg. A tápközeget perisztaltikus szivattyún keresztül, zárt hurkú áramkörben táplálják, és 2 naponta cserélik.

Albumin felvételi vizsgálat

az Albumin felvételét a nyomtatott 3D PT modellek, valamint a 2D kontrollok esetében értékelik. Az első kontroll szövetkultúra műanyagon termesztett Ptec-ekből áll, míg a második kontroll az ECM-en termesztett Ptec-ekből áll. Mindegyik esetben a Ptec-eket összefolyásig növesztik, és hagyják, hogy szérummentes táptalajban érjenek. A FITC-vel konjugált humán szérumalbumint (HSA-FITC, Abcam ab8030) PTEC táptalajban 50 Kb/mL-en szuszpendáljuk. Az összes mintát HSA-FITC-vel inkubáljuk közegükben 2 órán át (perfúzió esetén a nyitott lumenen keresztül perfundáljuk). Az expozíció után az összes mintát 3x térfogattal mossuk, majd 10x tripszinnel tripszinizáljuk az egyes sejtek összegyűjtésére. A sejtek fixek, és a megalin primer és szekunder antitestjeivel ellensúlyozottak (az S2 táblázat felsorolja az alkalmazott specifikus antitesteket). Az ezekből a mintákból származó sejteket és a meztelen sejteket áramlási citometriával (BD LSR Fortessa) elemezzük, és az adatokat mintánként n = 10 000 sejtből gyűjtjük. A HSA-FITC és a megalin képeinek megszerzéséhez a mintákat formalinnal rögzítik, ahelyett, hogy a mosási lépés után trizinizálnák őket. Ezeket a mintákat megalinra festették, és konfokális mikroszkóppal (Zeiss LSM710) leképezték.

ciklosporin a tesztelés

a CysA hatását mind a 2D kontrollokra, mind a bioprintált 3D PTs-re feltárják. A 2D-ben a sejteket 96-kút formátumban vetjük be a szövettenyészet műanyagán, és összefolyásig növesztjük. Az ATCC irányelvei szerint médiát táplálnak. A CysA-t (Sigma-Aldrich, SML1018) különböző koncentrációkban szuszpendálják a táptalajukban, és sejtekkel inkubálják 24 órán keresztül. a(3-(4,5-dimetiltiazol-2-IL)-5-(3-karboxi-metoxi-fenil)-2-(4-szulfofenil) – 2H-tetrazolium) fenazin-metoszulfát (MTS) jelenlétében történő életképességi vizsgálatot a 24 órás expozíció utáni jelnél végezzük. Ezt a vizsgálatot a PTECs-en fejezik be a korai összefolyáskor, azáltal, hogy CysA-t adnak a sejteknek azon a napon, amikor elérték az összefolyást, valamint a késői összefolyást, azáltal, hogy cysa-t adnak néhány nappal azután, hogy elérték az összefolyást. Különösen a toxicitási eredmények minden esetben hasonlóak (ábra. 5n). A 3D PTs esetében a CysA-t különböző koncentrációban táplálják az érett tubulusok nyitott lumenjén keresztül, miután elérték az összefolyást (~3 hetes jelnél), ahol a tápközegben legalább 10 napig nincs szérum. A CysA expozíció utáni 24 órás jelnél FITC-dextrán szivárgásvizsgálatot végeznek (az alábbiakban ismertetjük) a PTECs gátfunkciójának zavarainak felmérésére és számszerűsítésére. Közvetlenül ezt követően a PT-t 10% – os pufferolt formalinnal rögzítik 1 órára, és ellenfestik az aktint és a DAPI-t (az S2 táblázat felsorolja a használt foltokat).

diffúziós permeabilitás mérések

az epithelium gátfunkciójának 3D-ben történő értékeléséhez a diffúziós permeabilitást úgy számszerűsítjük, hogy a PTEC táptalajt a nyitott lumenben perfundáljuk, amely 25 6G/mL FITC-konjugált 70 kDa dextránt (FITC-Dex, Sigma termék 46945) 15 ml/perc sebességgel 3 percig, majd 1 ~30-45 percig. A teljes vizsgálatot élő sejtes képalkotás alatt végezzük, mind a tubulussal, mind a környező ECM-mel a látómezőben (ábra. S9). A FITC-Dex diffúziós mintázatát széles mezőjű fluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiovert 40 CFL) detektáljuk. A fluoreszcens képeket a perfúzió előtt, 3-5 percenként rögzítik 30-45 perc alatt. A FITC-Dex diffúziós permeabilitását a fluoreszcencia intenzitásának időbeli változásainak számszerűsítésével számítják ki a következő egyenlet alkalmazásával 34;

Pd a diffúziós permeabilitási együttható, I1 az átlagos intenzitás egy kezdeti időpontban, I2 egy átlagos intenzitás t ~ 30-45 perc, Ib a háttér intenzitása (a kép a fitc-Dex), D pedig a csatorna átmérője. Más kutatók arról számoltak be, hogy a Ptec-ek képesek felszívni a dextrán39-et, ami a mért diffúziós permeabilitás valamivel magasabb értékeihez vezetne.

az epithelialis bélelt tubulusaink barrier tulajdonságait egy alacsony molekulatömegű vegyület, az inulin (4,5 kDa) alkalmazásával is megvizsgáltuk, amelyet a Ptec-ek nem reszorbeálnak, sem nem szekretálnak in vivo a fent leírt módszerrel. Pontosabban, az inulin-FITC-t (Sigma termék F3272) melegített PTEC táptalajban oldjuk 100 ~g/mL-en, majd a nyitott lumenben 20 ~ ~ l/perc sebességgel perfundáljuk 3 percig, majd ezt követően 1,5 ~ ~ 15 percig. A teljes vizsgálatot élő sejtes képalkotás alatt végezzük, mind a tubulussal, mind a környező ECM-mel a látómezőben (ábra. S7). A fitc-inulin diffúziós mintázatát széles terepi fluoreszcens mikroszkóp (Leica) segítségével detektáljuk. A fluoreszcencia képeket kapuzott fényforrással és mozgásvezérelt fokozattal rögzítik a perfúzió előtt és 3-5 percenként a 15 perces időszak alatt, hogy összegyűjtsék a technikai háromszoros méréseket.

elektronmikroszkópia

a transzmissziós elektronmikroszkópiához (TEM), a 2D vagy 3D architektúrákban vagy a transzplantáció előtti standard biopsziából nyert egészséges emberi veseszöveteket 2,5% glutáraldehid, 1,25% paraformaldehid és 0,03% pikrinsav alkalmazásával rögzítjük 0,1 M nátrium-kakodilát pufferben (pH 7,4) legalább néhány órán keresztül. A kis mintákat (1 mm ~ 1 mm) eltávolítjuk és 0,1 M-es kakodilát pufferben mossuk, majd 1% ozmiumtetroxidban (OsO4) (EMS) és 1-ben fürdjük.5% kálium-ferrocianid (KFeCN6) (Sigma) 1 órán át, 3x vízben mosva, 1% – os vizes uranil-acetátban (EMS) inkubálva 1 órán át, majd 2 mosás vízben, majd az azt követő dehidratáció különböző alkoholtartalmakban (egyenként 10 perc; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). A mintákat ezután propilénoxidba (EMS) helyezzük 1 órán át, majd egy éjszakán át propilénoxid és TAAB Epon (Marivac Canada Inc.) 1:1 arányú keverékében inkubáljuk. St. Laurent, Kanada). A következő napon a mintákat TAAB Eponba ágyazzák, és polimerizálják 60 68 órán át. Az ultravékony metszeteket (kb. 60 nm) Reichert Ultracut-s mikrotómra vágják, ólom-citráttal festett rézrácsokra helyezik, JEOL 1200ex transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgálják, és a képeket AMT 2K CCD kamerával rögzítik. A képelemzés az ImageJ szoftver segítségével történik.

pásztázó elektronmikroszkópiához (SEM) a perfundált Ptec-eket 3D-ben rögzítik 10% pufferelt formalin alkalmazásával 1 órán át. a mintákat vékonyan szeleteljük (~1 mm vastag), hogy a nyitott lumenet körülhatároló sejteket feltárjuk. A fixálószert PBSx2 alkalmazásával mossuk le, majd ezt követően dehidratáljuk különböző minőségű etanolban (egyenként 20 perc; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). A mintákat ezután 50% etanolba és 50% hexametil-diszilazánba (HMDs) helyezzük 30 percig, majd 100% HMDS 3 60 percig. Minden lépést zárt és lezárt üvegtartályban hajtanak végre. A HMDs-sel végzett végső mosás után a mintákat eltávolítjuk, és egy nyitott tartályba helyezzük az N2 alatt a páraelszívóban, hogy megszáradjon. A szárított mintákat alumínium csapos tartókra szerelik fel vezetőképes szénszalaggal, Arannyal bevont porlasztóval és Tescan Vega SEM-vel.

immunfestés

immunfestést, majd konfokális mikroszkópiát alkalmaznak a fehérjék sejtes lokalizációjának értékelésére 2D és 3D PTEC modellekben. Az immunfestés előtt minden konstrukciót PBS-sel mosunk, majd 20 perctől 1 óráig rögzítjük 10% pufferolt formalin alkalmazásával. A fixálószert több mosással eltávolítjuk PBS-ben több órán át, majd egy éjszakán át blokkoljuk 1 Tömeg% szarvasmarha szérum albumin (BSA) alkalmazásával PBS-ben. A kérdéses sejtfehérje vagy biomarker elleni elsődleges antitesteket a konstrukciókkal 1 napig inkubáljuk az S2 táblázatban felsorolt hígításoknál 0,5 tömeg% BSA és 0,125 tömeg% Triton X-100 oldatban. A nem kötött primer antitestek eltávolítását PBS vagy 0,5 tömeg% BSA és 0,125 tömeg% Triton X-100 oldatával szembeni mosási lépéssel végezzük PBS-ben 1 napig. A másodlagos antitesteket a konstrukciókkal 1 napig inkubáljuk az S2 táblázatban felsorolt hígításoknál 0,5 tömeg% BSA és 0,125 tömeg% Triton X-100 PBS oldatban. A mintákat 2 órán át nucblue vagy ActinGreen festékkel festjük, majd a képalkotás előtt 1 napig PBS-ben mossuk.

képmegjelenítés és elemzés

a Fázisszerződéses mikroszkópiát egy fordított Leica DM IL scope segítségével végezzük, amelynek célkitűzései 1,25 X-től 40x-ig terjednek. a konfokális mikroszkópiát függőleges Zeiss LSM 710 segítségével végezzük, 5x-től 40x-ig terjedő vízimerítési célokkal, spektrális lézerek alkalmazásával 405, 488, 514, 561 és 633 nm hullámhosszon. A z-stackek képrekonstrukcióit az ImageJ-ben hajtják végre a Z-vetítés funkcióval, a maximális pixelintenzitás beállítással. A fényerő bármilyen növekedését egyenletesen hajtják végre egy teljes z-vetített képen. A 3D képrekonstrukciók és a forgatható filmek (Movie S3) az Imaris szoftver segítségével készülnek. Az inkubátor új CytoSMART (Lonza) rendszerét time-lapse képalkotás (Movie S2) rögzítésére használják. A diffúziós permeabilitás számszerűsítésére szolgáló képelemzést egyedi Matlab szkriptek alkalmazásával végezzük, korábban jelentett módszerek34 alkalmazásával. A TEM képelemzést az ImageJ szoftver segítségével végezzük a sejtmagasság (n 60), a mikrovillusok sűrűségének (n 25) és a mikrovillák hosszának (n 150) mérésére legalább 3 független mintán minden feltételhez.

Statisztikai analízis

az adatokat a következők szerint fejezzük ki: azt jelenti, hogy a standard deviáció (szórás, szórás, szórás, szórás, szórás). A statisztikai analízist MATLAB alkalmazásával végezzük, és a statisztikai szignifikanciát p < 0,05 értékkel határozzuk meg, amelyet egy ANOVA határoz meg Tukey többszörös páronkénti összehasonlító tesztjével. A különböző szignifikancia szinteket (p értékek) csillagokkal jelöljük, és az egyes ábra-jelmagyarázatokban konkrét p értékek szerepelnek.