az Aptamerek új kategóriaként jelentek meg a bioreceptorok területén, széles körű alkalmazásuk miatt, a bioszenzációtól a terápiáig. Szűrési folyamatuk számos variációjáról, az úgynevezett SELEXRŐL számoltak be, amelyek a végső felhasználásukhoz szükséges kívánt tulajdonságokkal rendelkező szekvenciákat eredményezhetnek.

egyszálú oligonukleotid létrehozása libraryEdit

a SELEX első lépése bizonyos hosszúságú teljesen vagy részben randomizált oligonukleotidszekvenciák szintézise, amelyeket meghatározott régiók szegélyeznek, amelyek lehetővé teszik a randomizált régiók PCR amplifikációját és az RNS SELEX esetében a randomizált szekvencia in vitro transzkripcióját. Míg Ellington és Szostak kimutatták, hogy a kémiai szintézis képes ~1015 egyedi szekvenciát generálni az oligonukleotid könyvtárak számára az in vitro szelekcióról szóló 1990-es tanulmányukban, azt találták, hogy ezeknek a szintetizált oligonukleotidoknak az amplifikációja a pool sokféleségének jelentős csökkenéséhez vezetett a PCR torzítás és a szintetizált fragmensek hibái miatt. Az oligonukleotidkészletet felerősítjük, és elegendő mennyiségű kezdeti könyvtárat adunk a reakcióhoz úgy, hogy minden egyes szekvenciából számos példány legyen, hogy minimalizáljuk a sztochasztikus események miatt bekövetkező potenciális kötési szekvenciák elvesztését. Mielőtt a könyvtárat bevezetnék az inkubációs és szelektív retenciós célpontba, a szekvencia könyvtárat át kell alakítani egyszálú oligonukleotidokká a célkötési tulajdonságokkal rendelkező szerkezeti konformációk elérése érdekében.

cél incubationEdit

közvetlenül a cél bevezetése előtt az egyszálú oligonukleotid könyvtárat gyakran felmelegítik és lassan lehűtik, hogy az oligonukleotidok termodinamikailag stabil másodlagos és harmadlagos struktúrákká váljanak. Az elkészítés után a randomizált könyvtárat immobilizált célponttal inkubáljuk, hogy lehetővé tegyük az oligonukleotid-cél kötést. Ennek a cél inkubációs lépésnek számos szempontja van, beleértve a cél immobilizációs módszert és a későbbi nem kötött oligonukleotid-elválasztás stratégiáit, az inkubációs időt és hőmérsékletet, az inkubációs puffer körülményeket, valamint a cél versus oligonukleotid koncentrációt. A cél immobilizációs módszerek példái közé tartoznak az affinitáskromatográfiás oszlopok, a nitrocellulózkötési vizsgálati szűrők és a paramágneses gyöngyök. A közelmúltban SZELEX reakciókat fejlesztettek ki, ahol a cél az egész sejtek, amelyek a teljes összefolyás közelében bővülnek, és inkubálják az oligonukleotid könyvtárat a tenyésztési lemezeken. Az inkubációs puffer feltételei a kiválasztott aptamer tervezett célpontja és kívánt funkciója alapján módosulnak. Például a negatív töltésű kis molekulák és fehérjék esetében magas sótartalmú puffereket használnak a töltésszűréshez, hogy a nukleotidok megközelítsék a célt, és növeljék egy adott kötési esemény esélyét. Alternatív megoldásként, ha a kívánt aptamer funkció in vivo fehérje-vagy egészsejt-kötődés a potenciális terápiás vagy diagnosztikai alkalmazáshoz, az in vivo plazmasókoncentrációkhoz és a homeosztatikus hőmérsékletekhez hasonló inkubációs puffer körülmények nagyobb valószínűséggel hoznak létre in vivo kötődő aptamereket. Az inkubációs puffer körülmények között egy másik szempont a nem specifikus versenytársak. Ha a reakció körülményei között nagy a valószínűsége a nem specifikus oligonukleotid-retenciónak, akkor nem specifikus versenytársak, amelyek a SELEX könyvtáron kívüli kis molekulák vagy polimerek, amelyek a könyvtár oligonukleotidjaihoz hasonló fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek, felhasználhatók ezen nem specifikus kötőhelyek elfoglalására. A cél-és oligonukleotidok relatív koncentrációjának változtatása szintén befolyásolhatja a kiválasztott aptamerek tulajdonságait. Ha a kiválasztott aptamer jó kötési affinitása nem jelent problémát, akkor a célfelesleg felhasználható annak valószínűségének növelésére, hogy legalább néhány szekvencia megkötődik az inkubáció során, és megmarad. Ez azonban nem biztosít szelektív nyomást a nagy kötési affinitáshoz, ami megköveteli, hogy az oligonukleotid könyvtár túlzott legyen, így verseny van az egyedi szekvenciák között a rendelkezésre álló specifikus kötőhelyekért.

kötési szekvencia elúció és amplificationEdit

miután az oligonukleotid könyvtárat elegendő ideig inkubáltuk a célponttal, a nem kötött oligonukleotidokat kimossuk az immobilizált célpontról, gyakran az inkubációs puffert használva, hogy a specifikusan kötött oligonukleotidok megmaradjanak. A nem kötött szekvenciák kimosásával a specifikusan kötött szekvenciákat eluálják olyan denaturálási körülmények létrehozásával, amelyek elősegítik az oligonukleotid kibontakozását vagy a kötési konformáció elvesztését, beleértve az ionmentesített vízben történő áramlást, karbamidot és EDTA-t tartalmazó denaturáló oldatok alkalmazásával, vagy nagy hő és fizikai erő alkalmazásával. A kötött szekvenciák elúciója után a visszatartott oligonukleotidokat RNS vagy módosított bázisszelekció esetén reverz-átírják a DNS-be, vagy egyszerűen amplifikáció céljából gyűjtik a DNS-SZELEX esetében. Ezeket az eluált szekvenciákból származó DNS-sablonokat ezután PCR-rel amplifikálják, és átalakítják egyszálú DNS-re, RNS-re vagy módosított bázis oligonukleotidokra, amelyeket a következő szelekciós kör kezdeti bemeneteként használnak.

Ssdnaedit megszerzése

a SELEX eljárás egyik legkritikusabb lépése az egyszálú DNS (ssdns) megszerzése a PCR amplifikációs lépés után. Ez bemenetként fog szolgálni a következő ciklusban, ezért létfontosságú, hogy az összes DNS egyszálú legyen, és a lehető legkevesebb veszjen el. A viszonylagos egyszerűség miatt az egyik leggyakrabban alkalmazott módszer a biotinilezett reverz primerek alkalmazása az amplifikációs lépésben, amely után a komplementer szálak egy gyantához köthetők, majd a másik szál elúciója lúggal. Egy másik módszer az aszimmetrikus PCR, ahol az amplifikációs lépést túl sok előremenő alapozóval és nagyon kevés fordított alapozóval hajtják végre, ami a kívánt szálból több előállításához vezet. Ennek a módszernek az a hátránya, hogy a terméket kettős szálú DNS-ből (dsDNS) és más, a PCR-reakcióból visszamaradt anyagból kell tisztítani. A nem kívánt szál enzimatikus lebomlását úgy hajthatjuk végre, hogy ezt a szálat egy foszfáttal vizsgált alapozóval jelöljük, mivel az enzimek, például a Lambda exonukleáz felismerik. Ezek az enzimek ezután szelektíven lebontják a foszfáttal jelölt szálat, így a komplementer szál érintetlen marad. Mindezek a módszerek a DNS körülbelül 50-70% – át visszanyerik. A részletes összehasonlítás lásd a cikket által Svobodov ons et al. ahol ezeket és más módszereket kísérletileg összehasonlítják. A klasszikus SELEX-ben a randomizált egyszálú könyvtárgenerálás, a cél inkubáció, valamint a kötési szekvencia elúció és amplifikáció fent leírt folyamatát addig ismételjük, amíg a megtartott készlet túlnyomó része célkötési szekvenciákból áll, bár vannak olyan módosítások és kiegészítések az eljáráshoz, amelyeket gyakran használnak, amelyeket az alábbiakban tárgyalunk.

negatív vagy ellenválasztás

az adott SZELEX eljárással kiválasztott aptamerek specificitásának növelése érdekében negatív szelekciót vagy ellenválasztást lehet hozzáadni a cél inkubálása előtt vagy közvetlenül azt követően. A cél immobilizációs mátrix komponensekhez való affinitással rendelkező szekvenciák kizárására a készletből negatív szelekciót lehet alkalmazni, ha a könyvtárat cél immobilizációs mátrix komponensekkel inkubálják, és a nem kötött szekvenciákat megtartják. A negatív szelekció felhasználható a célszerűhez hasonló molekulákat vagy sejteket kötő szekvenciák kiküszöbölésére az oligonukleotid könyvtár inkubálásával kis molekulájú cél analógokkal, nem kívánt sejttípusokkal vagy nem célfehérjékkel, és megtartva a nem kötött szekvenciákat.

A szelex reakció előrehaladásának nyomon követéséhez a célhoz kötött molekulák száma, amely megegyezik az eluált oligonukleotidok számával, összehasonlítható az oligonukleotidok becsült teljes bevitelével az elúciót követően minden körben. Az eluált oligonukleotidok száma az elúciós koncentráció becslésével becsülhető meg 260 nm hullámhossz-abszorbancia vagy az oligonukleotidok fluoreszcens címkézése révén. Amint a SZELEX reakció a befejezéshez közeledik, az oligonukleotid könyvtár azon része, amely megköti a célt, megközelíti a 100% – ot, oly módon, hogy az eluált molekulák száma megközelíti a teljes oligonukleotid bemeneti becslést, de alacsonyabb számnál konvergálhat.

figyelmeztetések és megfontolások

egyes SZELEX reakciók olyan próbákat hozhatnak létre, amelyek a primer kötési régióktól függenek a másodlagos szerkezet kialakulásához. Vannak aptamer alkalmazások, amelyekhez rövid szekvencia, tehát primer csonkolás kívánatos. Az eredeti módszer előrehaladása lehetővé teszi az RNS könyvtár számára, hogy kihagyja az állandó primer régiókat, amelyeket a szelekciós folyamat után nehéz lehet eltávolítani, mert stabilizálják azokat a másodlagos struktúrákat, amelyek instabilak, ha csak a véletlenszerű régió alkotja őket.