a myoepithelialis sejt morfológiája: immunhisztokémiai jellemzése nyugalmi fázistól mozgási fázisig
absztrakt
a myoepithelium a kutya emlődaganataiban nyugalmi és proliferatív szuprabasalis és orsó-és csillagközi sejtekként van jelen. A tanulmány célja négy különböző myoepithelialis sejt morfológiai típus azonosításának markereinek értékelése volt a normál és a neoplasztikus emlőmirigyben, valamint az immunhisztokémiai változások vizsgálata az epitheliumtól a mezenchimális fenotípusig. Citokeratin 19 (CK19), citokeratin 5/6 (CK5/6), citokeratin 14 (CK14), ösztrogénreceptor (ER), p63 fehérje, vimentin (VIM), és a simaizom-aktin (alfa-SMA) antitesteket 29 neoplazmán (3 jóindulatú és 3 rosszindulatú myoepithelialis daganat, 7 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 16 komplex karcinóma), valamint az emlőmirigyek normál szövetein alkalmazták. Mindezeket az antitesteket 3 emlőszöveten is tesztelték olyan állatokból, amelyekben nem volt emlő patológia. A myoepithelialis markerek jól expresszálódtak a szuprabasalis sejtekben, és fokozatosan elvesztek a motilis típusokban, a csillagsejtek csak a mesenchymára jellemző VIM expressziót tartják fenn. ER jelzett néhány nyugvó és mozgékony myoepithelialis sejtet. Eredményeink alapján javaslatot teszünk a myoepithelialis immotilis sejtekről a vándorló fibroblasztszerű sejtekre való áttérésre. Ez az átmenet és az immunhisztokémiai panel jellemzése A nyugalmi és mozgékony myoepithelialis sejtek számára jobban megvilágítja a myoepithelialis sejtek biológiai viselkedését.
1. Bevezetés
a kutyák emlőmirigy-daganatait mind epithelialis (epithelium és myoepithelium), mind mesenchymalis komponensek alkotják. A mezenchimális sejtek eredete még mindig vitatott. A myoepithelialis vagy bazális sejtproliferációt mutató daganatok megnövekedett gyakorisága a kutya emlődaganatok egyedülálló tulajdonsága .
a normál emlőmirigyben a luminát egy polarizált epiteliális sejtek belső rétege határolja, amely két külső vagy bazális epiteliális és myoepithelialis sejten nyugszik . Mind a bazális, mind a myoepithelialis sejtek szintetizálják a csatornák és alveolusok alapmembránját, és szerkezeti akadályt képeznek a luminalis hámsejtek és a környező stroma között . A csatornákban a myoepithelialis sejtek szinte folyamatos sejtréteget képeznek, amelyek a csatornák hosszú tengelyével párhuzamosan orientálódnak. Ez a réteg körülveszi a luminalis hámsejteket, és elválasztja őket az alapmembrántól és a sztrómától. Az alveolusokban a myoepithelialis sejtek szakaszosak, kosárszerű hálózatot képeznek az alveolusok körül, lehetővé téve egyes luminalis hámsejtek számára, hogy közvetlenül érintkezzenek az alapmembránnal . Ezért a myoepithelium nemcsak ideális helyzetben van a két rekesz közötti kommunikációhoz, hanem fontos szabályozó jeleket is biztosít a normál sejtszerkezet fenntartásához .
az immunhisztokémia alapján a normál emlőmirigy három sejtrétege különböző markereket mutat: a luminalis epitheliumot CK19 jelöli, a bazális sejteket és a myoepithelialis sejteket ck5/6, CK14 és p63, Alfa-SMA és VIM festi . A myoepithelialis sejtek kontraktilis elemek, amelyek kombinált epitheliális és simaizom immunprofilt mutatnak. A fent említett markereket a citoplazmában fejezzük ki, kivéve a P63-at, amely nukleáris marker . A myoepithelialis sejtréteg a P63 tumorszuppresszor egyetlen forrása, amely jelentősen gátolja a kapcsolódó tumorsejtek proliferációját és invázióját . Ezenkívül a normál emlőmirigy bazális myoepithelialis sejtjeit időnként ER antitest jelöli, amelyet a kutya emlődaganatok molekuláris alapú osztályozására használnak .
különböző myoepithelialis sejtmorfológiák ismerhetők fel kutyakomplex és vegyes tumorokban: nyugvó és proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtek és orsó és stellate motile interstitialis myoepithelialis sejtek. A suprabasalis sejtek az alapmembrán és a luminalis epithelium között helyezkednek el, és lapított orsót (nyugalmi sejteket) vagy sokszögű morfológiákat (proliferatív sejteket) mutatnak. Az intersticiális sejtek gyakran szilárd fészkekben vannak elrendezve, amelyek epitheliális elemekhez vannak rendelve, vagy az interstitiumban izoláltak . Az orsó és a csillag myoepithelialis sejtek differenciálódnak egy általánosabb kontraktilis fenotípus felé .
az intersticiális myoepithelialis sejtek végül fibroblasztszerű sejtekké válhatnak, amelyek csak VIM immunreaktivitást mutatnak . A myoepithelialis differenciálódás különböző mesenchymalis szövetek kialakulásához vezethet, beleértve a porcot és a csontot a kutya emlő vegyes daganatában.
a mezenchimális sejtek tipikus jellemzőinek megszerzése valószínűleg epitheliális-mezenchimális átmeneten (EMT) keresztül származik. Az EMT egy biológiai jelenség, amely lehetővé teszi, hogy a polarizált hámsejt, amely általában a bazális felületén keresztül kölcsönhatásba lép az alapmembránnal, több biokémiai változáson megy keresztül, lehetővé téve a mezenchimális sejtek tulajdonságainak és funkcióinak felvételét .
Ez a tanulmány a kutyák myoepithelialis sejtjeinek és emlődaganatainak különböző aspektusaira összpontosít, konkrétan (1) a négy különböző myoepithelialis sejt morfológiai típusainak jellemzése A normál és a neoplasztikus emlőmirigyben antitestek paneljének felhasználásával és (2) a myoepithelialis sejtek immunhisztokémiai változásai az epitheliálistól a mezenchimális fenotípusig.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Minták
29 nőstény kutya emlőmirigy mintáit a Bolognai Állatorvostudományi Kar Anatómopatológiai szolgálatának adatbázisából szerezték be. A tantárgyak volt, hogy különböző fajta: keverék (𝑛=13), német juhász (𝑛=3), Uszkár (𝑛=3), Yorkshire Terrier (𝑛=3), Tacskó (𝑛=2), Szetter (𝑛=1), Mutató (𝑛=1), Cocker spániel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), valamint a Szibériai Husky (𝑛=1); mind a nők, egy átlagos életkora 9.20±2.28 év (átlag ± SD). A daganatok a következőkből álltak: 3 jóindulatú myoepithelialis daganat, 3 rosszindulatú myoepithelialis daganat, 7 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 16 komplex karcinóma (az utolsó két csoportot a porc és/vagy csont jelenléte különböztette meg a vegyes daganatokban). Ezen felül 29 mintát értékeltek ugyanazon tumorvonal normál emlőmirigyeiből és 3 emlőmintát 3 egészséges, nem emlő daganatot hordozó nőstény kutyából.
a daganatokat Misdorp et al. és Goldschmidt et al. jóindulatú myoepithelialis daganatokba: ritka neoplazma, amely rövid kötegekben elrendezett myoepithelialis sejtekből áll, extracelluláris fibrilláris bazofil anyaggal keverve; rosszindulatú myoepithelialis daganatok: különbözik a jóindulatú változattól, polimorfabb myoepithelialis sejtekkel; komplex karcinóma: carcinoma, amely mind luminalis epithelialis, mind myoepithelialis komponensekből áll; carcinoma jóindulatú daganatban: olyan daganat, amelynek rosszindulatú megjelenésű hámsejtjei vagy az ilyen sejtek különálló csomói fordulnak elő mesenchymalis sejtekkel együtt, amelyek porcot és/vagy csontot termeltek, esetleg rostos szövetekkel kombinálva.
2.2. Immunhisztokémia
formalinba rögzített paraffinba ágyazott blokkokból négy, reprezentatív tumormintát tartalmazó, különböző vastagságú blokkot vágtunk ki. Ezeken a szöveteken a következő markerek immunhisztokémiáját végeztük: CK19, e, CK5 / 6, CK14, VIM, Alfa-SMA, p63.
A
szakaszokat toluolban viaszmentesítettük és rehidráltuk. Az endogén peroxidázt 0,3% – os hidrogén-peroxidba merítéssel blokkoltuk 20 percig. A szakaszokat ezután Tris pufferben öblítettük. Az antigén kinyerését citrát pufferrel (2,1 g Citromsav-monohidrát/liter desztillált víz), pH 6,0-val (kivéve a CK5/6 és ER-t, amelyek EDTA-t használtak, pH 8,0) végeztük, és két 5 percig melegítettük mikrohullámú sütőben 750 W-on, majd szobahőmérsékleten 20 percig hűtöttük. Az elsődleges antitesteket az 1. táblázat foglalja össze. Az összes elsődleges antitestet egy éjszakán át inkubáltuk 4 CAC-on, majd kereskedelmi sztreptavidin-biotin-peroxidáz technikával (LSAB Kit, Dako, Amszterdam, Hollandia). Kromogénként diaminobenzidint (0,05% 10 percig szobahőmérsékleten) használtunk. A tárgylemezeken Papanicolaou hematoxilinje volt.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
negatív kontrollként az elsődleges antitestet egy irreleváns, izotípusnak megfelelő antitesttel helyettesítettük a szekunder antitest nem specifikus kötődésének kontrollálására. Az azonos IHC protokollokat alkalmazó pozitív szövetkontrollok közé tartozott a kutya normál emlőmirigye (anti-CK19, -ER, -CK14, -VIM, Alpha-SMA, -p63 antitestek) és a kutya bőre (anti-CK5/6).
az egyes markerek pozitív sejtjeinek számát szemikvantitatívan számítottuk ki: − = nincs festett sejt, 6% – nál kevesebb pozitív sejt, + = 5-50% pozitív sejt, ++ = több mint 50% pozitív sejt. Az eseteket pozitívnak tekintették az ER szempontjából, amikor a tumorsejtek legalább 5% – ában nukleáris festést figyeltek meg .
3. Eredmények
morfológiájuk alapján a myoepithelialis sejtek négy típusát ismertük fel. A nyugalmi altípus az orsósejtek hosszúkás tulajdonságait mutatta, szoros kapcsolatban a luminalis hámsejtekkel, valamint a proliferáló szuprabasalis sejteket, amelyek ehelyett sokszög alakúak voltak (1.ábra(a)). Megfigyeltük, hogy az intersticiális motilis sejtek fészket képeznek (az orsós típusú bélelt fészkek és a csillagsejtek alkotják a fészekmagot), és elkülönítik az interstitiumban(2 (A) ábra).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
suprabasalis myoepithelialis sejtek: nyugalmi (vékony nyilak) és proliferatív (vastag nyilak) sejtek. Az IHC által alkalmazott antitestek panelének immunhisztokémiai expressziója, 63x (a) hematoxilin-eozin; (b) anti-CK19 antitestek, amelyek a citoplazmát jelölik; (c) anti-ER antitestek, amelyek a magokat jelölik; (d) anti-CK 5/6 antitestek, amelyek a citoplazmát jelölik; (e) anti-CK14 antitestek, amelyek a citoplazmát jelölik; (f) anti-VIM antitestek, amelyek a citoplazmát jelölik; (g) Anti-Alfa-SMA antitestek, amelyek a citoplazmatikus membránt jelölik; (h) anti-p63 antitestek, amelyek a magokat jelölik.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anti-VIM antitestek, amelyek a citoplazmát jelölik; (g) Anti-Alfa-SMA antitestek, amelyek a citoplazmatikus membránt jelölik; (h) anti-p63 antitestek, amelyek a magokat jelölik.
3.1. Normál emlőmirigy
a 3 kontroll esetben az összes nyugalmi és proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtet P63, CK14, Alpha-SMA és VIM jelöléssel látták el. A nyugalmi és proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtek egyik esetben sem expresszálták a CK19-et.
3.2. Az emlődaganat ugyanazon vonalából származó emlőszövet
a tumorokkal azonos vonalban lévő 29 normál szövetben az összes nyugalmi és proliferatív szuprabasalis myoepithelialis sejtet P63, CK14, Alpha-SMA és VIM jelölte. A CK5 / 6 négy eset kivételével mind pozitív volt, az ER pedig 12 esetben volt kimutatható. A CK19 expressziót csak a luminalis hámban figyelték meg. Myoepithelialis mozgékony intersticiális sejteket nem figyeltek meg. Az összes eredményt a 2. táblázat foglalja össze.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| * -: nincs foltos sejt; 5% – nál kevesebb pozitív sejt;+: 5-50% pozitív sejtek;++: több mint 50% pozitív sejtek. 6: a motilis fonotípus nem frissül, mert nincs jelen. 6: a szuprabazális fonotípus nem frissül, mert nem észlelhető a luminalis sejtek körül. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Emlődaganatok
A P63, CK14, CK5 / 6, CK19, Alpha-SMA, VIM és ER alkalmazásával végzett Szuprabasalis (1.ábra) és mozgósejtek (2. ábra) immunhisztokémiai eredményeit a 2. táblázat foglalja össze. Ck5 / 6 jelölt: suprabasalis nyugalmi sejtek 16 a 29 esetek (5 karcinóma jóindulatú vegyes tumorok és 11 komplex karcinómák). A CK 5/6 10 esetben proliferatív szuprabasális és orsós motilis sejteket is jelölt (3 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 7 komplex karcinóma). A Stellate motile sejtek 25 esetben voltak jelen (1 jóindulatú myoepithelialis daganat, 3 rosszindulatú myoepithelialis daganat, 5 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 15 komplex karcinóma), de negatívak voltak a CK5/6 szempontjából. Az emlő vegyes daganatokban a porc mindig negatív volt.
a CK14 23 esetben mutatott pozitivitást nyugvó sejtekben (1 komplex carcinoma, valamint jóindulatú és rosszindulatú myoepithelialis daganat kivételével), 22 esetben proliferatív sejtekben (6 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 15 komplex karcinóma), azzal a tendenciával, hogy elveszítik az expressziót, amikor ezek a sejtek megszerezték az orsósejtek mozgékonyabb fenotípusát (pozitív 2 jóindulatú és 3 rosszindulatú myoepithelialis daganatban, 2 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 2 komplex karcinóma). A vegyes daganatok kondrocitái negatívak voltak.
a Vim mind a 29 esetben pozitív volt a szuprabasalis sejtekben a benignus tumor és komplex carcinoma carcinoma 23 esetében, valamint a motilis myoepithelialis sejtekben. A stromális sejtek minden esetben pozitívak voltak. A porc mind a 7 karcinómában vim pozitív volt jóindulatú vegyes daganatokban.
Alfa-SMA jelölt nyugalmi és proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtek 23 karcinómában jóindulatú vegyes daganatokban és komplex karcinómákban. Az orsósejtek 10 esetben (5 karcinóma jóindulatú vegyes daganatban és 5 komplex karcinóma) pozitivitást mutattak az Alfa-SMA-ra. Mindegyik esetben, két komplex karcinóma kivételével, a csillagsejtek negatívak voltak. A Stroma csak 6 esetben mutatott pozitivitást (1 karcinóma jóindulatú vegyes daganatban és 5 komplex karcinóma).
a P63-at a benignus-kevert tumor és komplex carcinoma 23 carcinoma esetének nyugalmi és proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtjeiben mutatták ki. Minden orsós és csillagmozgató sejt negatív volt. A stromális sejtek és a porc negatív volt.
er expresszió 11 suprabasalis myoepithelialis sejtben volt jelen (4 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 7 komplex karcinóma); az orsó-és csillagmozgató sejtek 9 esetben voltak pozitívak (3 karcinóma jóindulatú vegyes daganatokban és 6 komplex karcinóma). A vegyes daganatok porcja negatív volt.
a nyugalmi és proliferatív suprabasalis és orsó / stellate motilis myoepithelialis sejtek egyik vizsgált tumorban sem expresszálták a CK19-et. A vegyes daganatok porcja szintén negatív volt a CK19 szempontjából.
4. Vita
A Gama et al. és Tateyama et al. , a myoepithelialis sejtek négy morfológiai típusa van jelen az emlőmirigyben: nyugvó és proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtek, amelyek alveolusokat és csatornákat, valamint orsó és csillagközi intersticiális motilis sejteket bélelnek, amelyek az intersticiális térben helyezkednek el, ahol fészkekben helyezkedhetnek el. A myoepithelialis markerek, mint például a p63, CK5/6, CK14, Alpha-SMA és VIM, értékes diagnosztikai kiegészítőknek bizonyultak a komplex és vegyes proliferációk értékelésének megkönnyítésében. A ck19-et a luminalis epithelium arany standard markerének tekintik, és a myoepithelialis sejtek téves diagnosztizálásának elkerülésére használták. A keresztreaktivitási minták és az a tény, hogy a léziós gócok jellemzően percesek, egyik myoepithelialis markernek sem volt 100% – os érzékenysége és specifitása a myoepithelialis sejtekre. Mint ilyen, legalább 2 markereket kell használni az adott fókusz értékeléséhez .
eredményeink alapján a suprabasalis sejtek legjobb markere a p63 volt, különösen a CK14-gyel összefüggésben, amely az érett (bazális) myoepithelialis sejtekre korlátozódott, és kisebb mértékben a CK5/6, Az Alfa-SMA és a VIM követte (1.ábra). A CK5 / 6 azonban luminalis hámsejteket is jelölt, ami megnehezítette a proliferatív suprabasalis myoepithelialis sejtek megkülönböztetését . Morfológiailag mind az epitheliális, mind a myoepithelialis sejtek sokszög alakúak lehetnek. Mind a CK14, mind a CK5/6 jellemzője, de a p63, az Alpha-SMA és a VIM esetében nem volt a csökkent expresszió a myoepithelialis sejtekben a suprabasalis proliferatív állapotban. A ck14, CK5/6 és p63 expresszió fokozatosan elveszett az orsó és a csillagmozgás állapotában lévő sejtekben.
Az Alfa-SMA és a VIM különböző intenzitású orsómotilis myoepithelialis sejtekben volt jelen. Csak a VIM bizonyult a stellate motile myoepithelialis sejtek következetes markerének. Ebben a tanulmányban a csillagmozgásos myoepitheliumot fészkekben rendezték el, és feltehetően alveoláris eredetű nyugalmi sejtek bélelték. Ez a tulajdonság alátámaszthatja azt az elképzelést, hogy a csillagmozgásos myoepithelialis sejtek fészkei, amelyek elvesztették a fő myoepithelialis suprabasalis markerek expresszióját, de megtartották a Vim iránti affinitást, a porc prekurzorai, jelezve, hogy ezek a sejtek befejezték a mezenchimális elemekké történő átalakulást. Benignus és malignus myoepithelialis tumorokban a VIM jelölés minden esetben, az összes többi suprabasalis myoepithelialis marker elvesztése, valamint az orsósejtekben a ck14 iránti csekély pozitivitás a myoepithelium motilis állapotának uralkodó expressziójára és az egyszerű myoepithelialis sejtekből a mesenchymalis fibroblasztokba való lehetséges átjutásra utal.
vizsgálatunkban a myoepithelialis sejtek mezenchimális fenotípusra váltásának bizonyítékát, amelyet a CK14, CK5/6 és p63 expresszió elvesztése mutatott, megerősítette az orsósejtek nem folyamatos címkézése az Alfa-SMA számára, amely mind a myoepithelialis sejtek, mind a myofibroblasztok markere, amely teljesen elveszett a csillagmozgásos sejtekben, amelyek állítólag fibroblasztokká váltak.
további megerősítő vizsgálatok Tsuda et al. jelentette a myofibroblasztok előfordulását a ck14 expresszió maradványaival (“átalakított myoepithelialis sejtekként”leírva). A jelen tanulmányban vizsgált esetekben a CK14 fokozatosan elhalványult, ezért a (myo-)epitheliális fenotípus elvesztését jelzi. Ezek az eredmények alátámasztják az EMT hipotézist, amely myoepithelialis-szerű állapotot foglal magában, amely myoepithelialis mesenchymalis átmeneten (MMT) megy keresztül. Ezt a hipotézist a kutyában megerősítette G Enterprtner et al. a who kijelentette, hogy az emlődaganatokban a mezenchimális sejtek evolúciójának egyik lépése a tipikus myoepitheliális tulajdonságok kifejeződését jelenti.
a jelen vizsgálat érdekes eredménye az ER-re való pozitivitás volt, amelyet 12/29 suprabasalis myoepithelialis sejtekben és 9/29 carcinoma csillagsejtekben találtak jóindulatú vegyes daganatokban és komplex carcinomákban. Az ER receptorok két izoformáját írták le, nevezetesen az ER-xhamstereket és az ER-xhamstereket, ez utóbbi az egyetlen forma, amely az izolált bazális-myoepithelialis sejtek magjaiban fejeződik ki . A jelen vizsgálatban alkalmazott antitest mindkét izoformát tartalmazta: mind a luminalis, mind a bazális/csillagsejteket jelöltük, feltehetően a luminalis sejteket az ER-6, a bazális/csillagsejteket pedig az ER-6.
összefoglalva, a suprabasalis myoepithelialis sejteket jól jellemezte a p63 és a CK14, és kisebb mértékben a többi használt marker. A mozgékony myoepithelialis sejteket ehelyett az Alfa-SMA és a VIM jellemzi, valamint a CK14, CK5/6 és p63 elvesztése (2.ábra). Ez a tanulmány mind a luminalis epithelialis, mind a suprabasalis/stellate myoepithelialis sejtekben (az utóbbi az esetek körülbelül felében) kimutatta az ER-t, és hogy az ER-expressziót nem befolyásolja a nyugalmi/mozgási fázis. Ezért soros vagy többfoltos szakaszokban az ER immunhisztokémiája P63-mal és CK14-gyel kombinálva segíthet elkerülni a luminalis vagy myoepithelialis sejtek téves azonosítását a kutya emlődaganataiban. A megőrzött Alfa-SMA és VIM expresszió trendje az orsósejtekben, és csak a Vim pozitivitás a stellate motilis sejtekben, valamint a csökkent p63 expresszió mindkét motilis típusban alátámasztja azt a hipotézist, hogy az EMT myoepithelialis-szerű állapotot foglal magában az MMT-ben. Az orsó mozgékony sejtje korábbi transzformációnak tekinthető, mint a csillagsejt a mezenchimális fenotípus felé.
szerzői hozzájárulás
ezek a szerzők egyaránt hozzájárultak ehhez a munkához.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.
elismerés
a szerzők köszönetet mondanak Anne Collins asszonynak az angol szöveg szerkesztéséért.
kiegészítő anyagok
1.Kiegészítő táblázat: immunhisztokémiai eredmények.
2.Kiegészítő táblázat: életkor, fajta és klinikai leletek.
- Kiegészítő anyag