vizsgálati alanyok, klinikai minták és HLA genotipizálás. Minden olyan személyt, akinek kórtörténetében vérátömlesztés volt, kizárták a vizsgálatból. Harminckét családot vettek fel és vizsgáltak HLA II. és I. osztályú allélokra; 3 generációt vizsgáltak 20 családnál és 2 generációt 12 családnál. Három generációra volt szükség a tanulmányi belépéshez minden gyermekes nő számára, és minden gyermek részvételére volt szükség, mert a mikrokimerizmus az anyától vagy a gyermektől származhat ezekben az alanyokban. A férfiak, a gyermekek és a soha nem terhes nők részvételével 2 generáció (azaz az alany és az anya) vett részt. Egy scleroderma beteg iker volt; az érintetlen ikert is felvették a vizsgálatba. Harminchárom egészséges kontroll családot toboroztak, köztük 22-et 3 generációval, 11-et pedig 2 generációval. A HLA genotipizálását összesen 254 egyénre végezték el: 128 a scleroderma családokban és 126 A kontrollokban. Néhány további családtagot bevontak a HLA haplotípus-hozzárendelésének megerősítésére. Ebből az adatbázisból az alanyokat további vizsgálatokra választották ki, amikor az alany anyjának nem megosztott HLA allélja volt, amelyet HLA-specifikus vizsgálatok céloztak meg. Minden alany tájékozott beleegyezést adott a Fred Hutchinson Rákkutató Központ intézményi felülvizsgálati testülete.

a Pbmc-ket teljes heparinizált vérből HBSS-ben történő hígítással izoláltuk, majd Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Svédország) gradiens centrifugálással 1,077 g/mL-en. Néhány gyermek esetében a DNS-t a hajgyökérből kivontuk a HLA tipizáláshoz a korábban leírtak szerint (9). A genomi DNS-t a Pbmc-kből egy Izoquick nukleinsav extrakciós készlet (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), a gyártó utasításai szerint, 10 mM-es Tris-HCl-ben (pH 9,0) reszuszpendálva. A DNS mennyiségét és tisztaságát standard spektrofotometriás módszerekkel határoztuk meg. Egyes alanyok esetében a DNS-t közvetlenül a teljes vérmintákból nyerték ki.

DNS-alapú tipizálást alkalmaztak szekvencia-specifikus oligonukleotid szondapanelekkel a specifikus allélok azonosítására a DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 és DQB1 lokuszokban. A DRB1 esetében egy kezdeti alacsony felbontású vizsgálat kimutatja a DBR1*01-DRB1*14 DRB1 családokat, majd 1 vagy több nagy felbontású vizsgálatot követ, amelyek azonosítják a specifikus DRB1 allélokat a korábban leírtak szerint (10, 11). A DQA1 és DQB1 allélokat a korábban leírtakhoz hasonló módszerekkel határoztuk meg (9), további próbákkal kiegészítve az újonnan azonosított allélok kimutatására (12). A HLA I. osztályú antigéneket standard lymphocytotoxicitási vizsgálattal határoztuk meg, amely 20 HLA-A, 30 HLA-B és 8 HLA-Cw antigént különböztet meg. Néhány mintát szekvenálásnak vetettünk alá a specifikus HLA I. osztályú allélek meghatározására (13). A HLA allél és antigén hozzárendelések és homozigozitás megerősítésére több családtagot genotipizáltak — beleértve az alanyok apjait és testvéreit, ha rendelkezésre állnak.

HLA-specifikus PCR primerek. A Primer szekvenciákat az összes ismert allélszekvencia alapján terveztük (12). A Primer szintézist Oligók stb. (Wilsonville, Oregon, USA). Az egyik alapozó készletet úgy tervezték, hogy megcélozza a HLA I. osztályú polimorfizmust, a 3 pedig a HLA II.osztályú polimorfizmust. A HLA-B44 megcélzásához egy primert terveztek, amely felerősíti a HLA-B allélek egy csoportját a 66., 69. és 75. exon polimorfizmusai alapján, valamint a HLA-B allélek egy másik csoportját a 229. exon polimorfizmusa alapján. A primerek kombinációja specifikusan amplifikálja a HLA-B44 allélokat, 190 bp fragmentumot hozva létre. Az összes DRB-specifikus primert úgy tervezték, hogy felerősítse az allélcsoportokat a szekvencia polimorfizmusok alapján a 2.exon hipervariábilis régiójában. A HLA-DRB5 * 01 esetében az egyik primer a drb5*01 allélek egy csoportját erősíti a 25., 26., 31., 32. és 38. pozíció polimorfizmusai alapján, a másik pedig a DRB5*01 allélek egy csoportját erősíti a 215. és 231. pozíció közötti polimorfizmusok alapján. A primerek kombinációja specifikusan amplifikálja a HLA-DRB5 * 01 allélokat, 210 bp fragmentumot hozva létre. A HLA-DRB1 * 04 esetében az egyik primer a DRB1*04 allélek egy csoportját erősíti a 25., 26., 31. és 36. pozíció polimorfizmusai alapján, a másik pedig a DRB1*04 allélek csoportját erősíti a 97. és 110. pozíció polimorfizmusai alapján. A primerek kombinációja specifikusan amplifikálja a DRB1 * 04-et, 104-bp fragmentumot hozva létre. A DRB1*04 allélok további megkülönböztetését úgy értük el, hogy az előbbi primert 1/2 primerrel együtt alkalmazták, amelyek megkülönböztetik a dimorfizmust a 258.pozícióban (kodon 86), 263 bp fragmentumot produkálva. A HLA-DRB1*11 esetében az egyik primer felerősíti a DRB1*11 allélek csoportját a pozíciókban lévő polimorfizmusok alapján 25, 26, 28, 30, 31, 32, és a 35 exon 2, és a második primer felerősíti a DRB1 * 11 allélek csoportját a polimorfizmusok alapján a 173.és 174. exon 2. pozíciójában. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. A PCR–reakciókat 50 db/ml térfogatban végeztük, amely 1,25-1,5 ~ g genomi DNS-t, 10 mmol/L trisz-HCl-t (pH 8,3), 50 mmol/L KCl-t, 1,5 mmol MgCl2-t, 0,001 tömegszázalék zselatint, 260 ml/l dezoxinukleotidot, 0,5 U Perfect Match PCR Enhancer-t (Stratagene, La Jolla, California, USA), 2,5 U Amplitaq arany DNS polimerázt (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) és 20 pmol minden HLA-specifikus alapozóból. Ultratiszta vizet adtunk hozzá, hogy a végső térfogat 50 6L legyen. Erősítés állt, 5 perc, 96°C-on, 35 ciklus a 95°C-on 35 másodperc alatt 65°C-35 másodperc HLA-B44 (58.5°C-DRB5*01; 72°C-DRB1*04; 64.5°C-DRB1*11), majd a 72°C-on 1 percig, a végleges kiterjesztését lépés 72°C-on 10 percig. Az optimális amplifikációt, érzékenységet és specifitást az MgCl2 titrálásával, valamint a primer koncentrációk, a termociklusok száma és az izzítási hőmérséklet titrálásával értük el. Az összes amplifikációt egy GeneAmp System 9600 termociklerben (Perkin-Elmer Applied Biosystems) hajtottuk végre. A vizsgálat érzékenységét spiking kísérletekkel határoztuk meg, amelyekben a cél DNS-t sorozatosan hígítottuk, és az alany alléljainak megfelelő rögzített mennyiségű háttér DNS-hez adtuk. A HLA-B44-és DRB5*01-specifikus PCR– vizsgálatok legalább 1 célsejtet tudtak kimutatni a háttérben 500 000 sejt; a HLA-DRB1*04-és DRB1*11-specifikus PCR-vizsgálatok legalább 1 célsejtet tudtak kimutatni a háttérben 100 000 sejtből. Minden PCR-vizsgálat a következő kontrollokat tartalmazta: (a) A DNS pozitív kontrollja egy sejtvonalból a HLA alléllel (0,2-0,5 6G); (b) pozitív kontroll az alany anyjától (0,2–0,5 6G); (c) a DNS negatív kontrollja az alanyéval azonos HLA allélokkal rendelkező sejtvonalból (1,25 ezer g és 0,35 ezer g); és (D) negatív kontroll az összes DNS nélküli PCR reagensből. A PCR termékeket 100 V állandó feszültségen 1 órán át elektroforézissel 6% vagy 8% előregyártott TBE gélekben Novex Xcell II Mini-cellával (Novex, San Diego, Kalifornia, USA). Mindegyik gél tartalmazott pozitív és negatív PCR kontrollokat és egy 100 bp-s létrát (SLL-100; Gensura, Del Mar, Kalifornia, USA). A géleket ezüst folttal festették (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA), és szárítjuk a Dryease gél szárító rendszer (Novex). A teljes vérből kivont DNS-t 4 mintában teszteltük elégtelen mennyiség a Pbmc-k izolálásához. Minden vizsgálatot két példányban végeztek, és a legtöbb mintát többször is megvizsgálták.

PCR óvintézkedések. A PCR esetleges szennyeződésének elkerülése és kimutatása érdekében rendkívüli óvatossággal járt el. Külön területeket használtunk a pbmc szétválasztására, a genomi DNS extrakciójára, a PCR beállítására és amplifikálására, valamint a PCR termékek elemzésére, külön laboratóriumokban végzett PCR előtti és utáni vizsgálatokkal. Aeroszolálló pipettahegyek (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Kalifornia, USA) használták minden kísérletben, és több negatív kontrollt is bevontak az összes PCR amplifikációba.

HLA-specifikus PCR termékek szekvenálása. A kezdeti HLA-specifikus PCR termék hét mikroliterjét további 40 amplifikációs ciklusnak vetettük alá az eredeti hőciklus paramétereinek felhasználásával. Ebből a PCR-termékből harminc mikrolitert elektroforézissel 1,75% – os ultratiszta agaróz gélben (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) etidium-bromid oldattal festettünk (0,5 ~ g/mL). A szalagot egy QIAquick gél extrakciós készlet (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornia, USA). A tisztított PCR terméket eluáltuk 30 60 mmol trisz-HCl (pH 9,0), és 100 ng-t adtunk egy reakcióelegyhez, amely 8,0 ml szekvenáló reagens előkeveréket tartalmazott (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol 5′ vagy 3 ‘ alapozó, és 1 6L DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Ultratiszta vizet adtunk hozzá, hogy a végső térfogat 20 MHz legyen. A szekvenálási reakcióelegyeket 96 6CC-n 3 percen át Hevítettük egy 9600-as GeneAmp-rendszerű hőciklusban, majd 25 ciklust 96 XC-n 10 másodpercig, 50 XC-n 5 másodpercig, 60 XC-n 4 percig. A kapott PCR-termékeket a fentiek szerint oszloptisztítottuk és elektroforézissel láttuk el. Az érzékszervi és antiszensz szekvenciákat két példányban határoztuk meg az alany és az anya HLA-specifikus PCR termékeire, valamint a pozitív kontroll sejtvonal PCR termékeire. A szekvenciaelemzést a Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA) Wisconsin csomag 9.1-es verziójú szoftverével végeztük.

Citospin dia előkészítése és in situ hibridizáció. A Cytospin slide készítményeket X és Y kromoszóma–specifikus szekvenciák jelenlétére elemeztük a Fred Hutchinson Cancer Research Center molekuláris citogenetikai laboratóriumában kifejlesztett technikával a kimérizmus kvantitatív elemzésére a nemekkel nem egyező őssejt-transzplantációs párokban (14). A hímivarsejtek citospin mintáit 30 000-60 000 frissen elválasztott Pbmc centrifugálásával állítottuk elő üveglemezekre, 300 db / dia. A tárgylemezeket a használatig szárító kamrában tárolták. Az X kromoszóma-specifikus dxz1 (15) szondát nick-transzlálták digoxigeninnel, az Y kromoszóma–specifikus dyz1 (16) szondát pedig nick-transzlálták biotinnal. Az XY szondakeverék végső koncentrációja mindegyik szondából 0,5 ~ g/mL volt 50% formamid hibridizációs pufferben, 2 ~ SSC (0,3 M nátrium-klorid és 0,03 M nátrium-citrát) és 10% dextrán-szulfát. Denaturáltuk 72 6CC-on 5 percig, jégen hűtöttük, és a csúszdára helyeztük. A diákat pepszinben emésztettük (0,1 mg / mL 0-ban.01 M HCl) 37 perc alatt 3 perc alatt, 4% pufferolt formalinban rögzítve 15 percig, PBS-ben öblítve, etanolban dehidratálva (70%, 95% és 100%), és levegőn szárítva. A tárgylemezeket denaturáltuk 2 (72) 60 perces, 70% – os formamiddal, 2 (72 (72)) 3 perces kezeléssel, etanolsorozatban dehidratáltuk (-20 (20)) és levegőn szárítottuk. Tíz mikroliter szondát vittünk fel a tárgylemezre, majd gumi cementtel lezárt fedőlemez (22 62 mm) alá szereltük. Egy éjszakán át inkubáltuk 42cc-n nedvesített kamrában. A tárgylemezeket 55% – os formamidban, 2 db (45 dB) SSC-ben 15 percig, 2 db (szobahőmérsékletű) SSC-ben 5 percig mostuk. A szondajeleket egyidejűleg detektálták fluoreszcein-kapcsolt anti-digoxigeninnel (1:500 hígítás; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) és Texas vörös–kapcsolt avidinnel (1: 500 hígítás; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA) 30 percig szobahőmérsékleten sötétben. Mosás után 2 db SSC-vel és PBS-vel VECTASHIELD (Vector Laboratories) felszerelték őket. A diákat közvetlenül egy Nikon E600 epifluoreszcens mikroszkóppal értékelték, 100 W-os higanylámpával, amely megfelelő egy -, két-és háromsávos szűrőkkel van felszerelve. Csak a 2 látható kromoszómajellel rendelkező sejteket soroltuk fel, elektronikus javítás nélkül.