Bevezetés

A szalmonella emberi szalmonellózist és melegvérű állatok fertőzését okozza (Kingsley and B), 2000). A Salmonella nemzetség két fajra oszlik, S. enterica és S. bongori. a szerotipizálás tovább osztályozza a szalmonellát több mint 2600 szerotípusra (szerovárokra) az antiszérumok agglutinációs reakciója révén három o, H1 és H2 felszíni antigénre (Le Minor and Bockem ons, 1984; Le Minor et al., 1990). Vannak 46 o antigének, amelyek azonosítják a szerocsoportot. 119 H1 és H2 flagellin antigénnel együtt az O, H1 és H2 kombinációk azonosítják a szerovarokat. A szerovárok csak kis része felelős az emberi szalmonellafertőzések többségéért (Popoff et al., 2004).

az antigén agglutinációval történő Szerotipizálást molekuláris szerotipizálás váltja fel (Cai et al., 2005; Wattiau et al., 2011). Ez az O antigén géncsoport, a H1 antigén kódoló Flic gén és a H2 antigén kódoló fljb gén szekvenciájának vizsgálatával érhető el (Fitzgerald et al., 2007). O az antigén géncsoportokat gének jelenléte vagy hiánya alapján lehet megkülönböztetni, míg a H1 és H2 antigéneket szekvenciaváltozás alapján lehet megkülönböztetni (McQuiston et al., 2004; Guo et al., 2013; Zhang et al., 2015). A szalmonella szerotípusokra az MLST-n keresztül is következtetni lehet (Wattiau et al., 2011; Achtman et al., 2012), mint szerotípusra szekvenciatípusai alapján lehet következtetni. Ennek a megközelítésnek azonban előfeltétele, hogy a szerovár megfelelő kapcsolatának előzetes ismerete szekvencia Típus szükséges.

a közelmúltban, a teljes genom szekvencia-alapú összehasonlítás, számos tanulmány azonosította a genomi markereket alternatív molekuláris módszerként a szerotipizáláshoz. Zou et al. (2016) hét olyan gént azonosított, amelyek elegendő felbontást biztosítanak 309 szalmonella törzs megkülönböztetéséhez, amelyek 26 szerovárt képviselnek, és 13 szerovár-specifikus gént találtak a 26 szerovárban. Laing et al. (2017) pán-Genom elemzéssel azonosította a szalmonella fajokra és alfajokra jellemző genomi fragmentumokat. Ezeket a specifikus géneket vagy DNS-fragmenseket molekuláris célpontként használták fel a szalmonella gyors azonosítására és kimutatására szolgáló többszörös molekuláris vizsgálatok kifejlesztésére fajok és szerovar szinten. Ezeknek a specifikus géneknek vagy DNS-fragmenseknek azonban korlátozott a diszkriminatív képessége, mivel képesek csak kisebb számú szerovárt megkülönböztetni.

ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy a Salmonella genomok széles körű nyilvánosan elérhető gyűjteményét használjuk a szerovár-specifikus génmarkerek azonosítására a leggyakoribb Salmonella szerovárok számára. Megmutatjuk ezeknek a szerovár-specifikus génmarkereknek a potenciálját a molekuláris szerotipizálás markereként, akár a genomi adatok silico tipizálásában, akár laboratóriumi diagnosztikai módszerek kidolgozásában.

anyagok és módszerek

riboszomális MLST ST alapú izolátum kiválasztás

A szalmonella adatbázis az Enterobázisban (Alikhan et al., 2018) 2018 márciusától 118997 izolátumot vizsgáltak. Az egyes RST-k reprezentatív izolátumait egy házon belüli python szkript választotta ki és vonta ki. Csak a négynél több RST-vel rendelkező szerovarokat vonták be ebbe a vizsgálatba. A 20 legnagyobb szerovár esetében a reprezentatív izolátumokat csak véletlenszerűen választották ki két vagy több izolátummal rendelkező RST-k közül. A fennmaradó szerovárok esetében minden egyes rST-hez egy reprezentatív izolátumot véletlenszerűen választottunk ki. Ezeknek az izolátumoknak a nyers olvasmányait az ENA-ból (European Nucleotide Archive1) szereltük le, és De novo-val állítottuk össze SPAdes v3.10.1 assembler alapértelmezett beállításokkal2 (Bankevich et al., 2012). Az összeszerelt genomok szerovárját SISTR (Yoshida et al., 2016), miután teljesítették a következő kritériumokat, amelyeket Robertson et al. (2018) a QUAST3 használatával (Gurevich et al., 2013): assembly mérete között 4 és 6 Mb a száma contigs kevesebb, mint 500, a legnagyobb contig nagyobb, mint 100 kb, GC tartalom között 50 és 54%, gén által megjósolt glimmer belül QUAST több mint 3000. Megvizsgáltuk a kapott SISTR szerovár-előrejelzések és az Enterobase metaadatrekordban jelentett szerovár közötti összhangot, és az inkonzisztens szerovár-előrejelzések miatt kis számú genomot eltávolítottunk az elemzésből. A végső adatkészlet 2258 kiváló minőségű genomból állt, következetes szerovár-előrejelzéssel, amely 107 szerovárt képvisel (S1 kiegészítő táblázat).

A szalmonella Szerovár-specifikus jelölt Génmarkerek azonosítása

a 107 szerovár potenciális szerovár-specifikus génmarkereinek meghatározásához a 2258 genomot prokka segítségével jegyeztük fel (Seemann, 2014). A pán-genomot és a mag-genomot Roary (Page et al., 2015) 80% – os szekvencia-identitási küszöböt használva. Az egyes szerovárokra jellemző géneket a pán-Genom kiegészítő génjeiből azonosítottuk egy házon belüli python szkript segítségével. Ebben a tanulmányban egy adott szerovár genomjainak számát, amely az adott szerovár specifikus génjét tartalmazza, true positive (TP) – nek, az ugyanazon szerovárból származó genomok számát hamis negatívnak (FN) nevezték. Az azonos szerovár-specifikus gént tartalmazó más szerovárok genomjainak számát hamis positve-nek (FP) nevezték. Lazított határértékeket (20% FN, 10% FP) használtak kezdetben annak biztosítása érdekében, hogy minden szerovárnak legyen jelölt specifikus génje, amelyet tovább lehet vizsgálni. Paralóg géneket távolítottak el az elemzésekből.

A potenciális Szerovár – specifikus Génmarkerek értékelése

az F1 pontszámot használták a potenciális szerovár-specifikus génmarkerek kezdeti kiválasztásához. Az F1 pontszámot a következő képlet alapján értékeltük: 2 (PPV + érzékenység)/(PPV+érzékenység), ahol a PPV-t TP/(TP+FP), az érzékenységet pedig TP/(TP + FN) határozták meg. Az F1 0-tól 1-ig terjed, ahol az 1 azt a szerovár-specifikus gént jelenti, amely egy adott szerovár összes genomjában jelen volt, más szerovárok összes genomjában pedig hiányzott. A szerovár-specifikus génmarkereket az egyes szerovárok legjobban teljesítő génjének felhasználásával választottuk ki az F1 pontszám alapján. A Tn/(TN+FP)-ként definiált specifitást használtuk a szerovár-specifikus génmarkerek valódi negatív (TN) arányának értékelésére. A hamis pozitív arányt (FPR) az 1 – TNR határozta meg.

filogenetikai elemzések

a jelölt szerovár-specifikus génmarkerekben megfigyelt álnegatív és FPRs okainak meghatározása érdekében megvizsgáltuk az érintett szerovárok filogenetikai összefüggéseit. Az 1258 izolátum tervezetét filogenetikai fák előállítására használták parsnp v1.24 (Treangen et al., 2014) alapértelmezett paraméterekkel a szerovárok közötti és azokon belüli filogenitás meghatározásához. A fát a FigTree v1.4.3 (Schneider et al., 2000).

A Szerovár-specifikus Génmarkerek helye és funkciói

reprezentatív teljes genomokat töltöttek le az NCBI5-ből, és az egyes jelölt szerovár-specifikus gének helyének meghatározására használták blastn alapértelmezett beállításokkal (2.2 verzió.6, S2 Kiegészítő Táblázat). Reprezentatív teljes genom nélküli szerovarokban reprezentatív genomot választottak ki az ebben a vizsgálatban összeállított izolátumokból. A szerovár-specifikus génmarkerek szekvenciáit az S1 kiegészítő adatok tartalmazzák. A gének csoportosulását a genomban annak vizsgálatára használták, hogy a szerovár-specifikus génmarkerek potenciálisan egy szerovár által egy esemény során nyert egyetlen elem részei-e. A jelölt szerovár-specifikus génmarkereket klaszternek tekintették, ha egymástól kevesebb, mint 5 kb távolságra helyezkedtek el.

a génmarkerek funkcionális kategóriáit a RAST annotációból azonosítottuk6 (Aziz et al., 2008). A szerovárok referencia genomjain belüli profágszekvenciákat FASZTER alkalmazásával azonosítottuk annak jelzésére, hogy a szerovár-specifikus génmarkerek megszerezhetők-e a profágokkal együtt (Fágkereső eszköz továbbfejlesztett kiadás) (Arndt et al., 2016).

in silico szerotípus-előrejelzés Szerovár-specifikus Génmarkerek alkalmazásával

további 1089 izolátumot választottunk ki az Enterobázisból egy házon belüli python szkript segítségével, 2258 izolátum kivételével, amelyeket a kezdeti szűréshez használtak ugyanabból az adatbázisból 2018 márciusától (S3 kiegészítő táblázat). A BLASTN-t arra használták, hogy az 1089-hez tartozó 106-hoz tartozó genomokkal keressék a szerovár-specifikus génmarkerek bármelyikének jelenlétét. Ezután egyedi python szkripteket használtak a szerovár előrejelzésére ezekből a szerovár-hozzárendelésekből az egyes szerovárok ismert gén jelenlét mintája alapján. A TP – t a helyesen hozzárendelt szerovárok teljes számaként osztályozták, valamint azokat az eseteket, amikor a helyes szerovárt hívták, valamint egy vagy több FP-t. A sikertelen hozzárendelést akkor határozták meg, ha nem hívtak szerovárt vagy helytelen szerovárokat. A szerovár-előrejelzéseket összehasonlítottuk a SeqSero-val (Zhang et al., 2015) és SISTR jóslatok.

A jelölt Szerovár-specifikus Génmarkerek specificitásának kiszámítása a közös Szerovárokra

a tipizálási sebesség specifitása a közös szerovárokra (Hendriksen et al., 2011) egyenlő volt (1 – potenciális hibaarány). A szerovár-specifikus génmarkerek potenciális hibaaránya, amelyet a következő képlet határoz meg: (FPs száma) (az adott szerovár gyakorisága egy adott régióban)/(az adott szerovár összes genomja).

eredmények

jelölt Szerovár-specifikus Génmarkerek azonosítása

a 2258 genomból származó kiegészítő géneket, amelyek 107 szerovárt képviselnek, szűrtük a potenciális szerovár-specifikus génmarkerek azonosítására. Ez a kezdeti szűrés 354 potenciális szerovár-specifikus génmarkereket azonosított 101 szerováron belül. Hat szerovár, nevezetesen a Bareilly, a Bovismorbificans, A Thompson, a Reading, A Typhi és a Saintpaul nem rendelkezett olyan jelölt szerovár-specifikus génmarkerekkel, amelyek egy adott szerovár minden ágában jelen voltak. A 354 jelölt szerovár-specifikus génmarkerek specificitását (TNR) és érzékenységét (TPR) szintén megvizsgáltuk, és az 1.ábrán foglaltuk össze. Negyven szerovár 194 szerovár-specifikus génmarkereket tartalmazott 100% – os specifitással és érzékenységgel (nincs FN vagy FP), míg 31 szerovár 80 jelölt szerovár-specifikus génmarkereket tartalmazott 100% – os érzékenységgel, de kevesebb, mint 100% – os specifitással (változatos FP). Kilenc szerovár 27 jelölt szerovár-specifikus génmarkereket tartalmazott, 100% – os specifitással, de kevesebb, mint 100% érzékenységgel (változatos FN). A fennmaradó 21 szerovár 53 jelölt szerovár-specifikus génmarkereket tartalmazott, mind a specificitás, mind az érzékenység kevesebb, mint 100% (változatos FN és FP).

filogenetikai fát készítettünk 1258 reprezentatív izolátum felhasználásával 107 szerovárból ParSNP segítségével (S1 kiegészítő ábra). Az 1258 izolátumot a kezdeti 2258 izolátum filogenetikai kapcsolatai alapján választottuk ki, amelyekből izolátumokat választottunk ki az egyes független származások képviseletére. Megállapítottuk, hogy a 82 szerovár mindegyikének tagjai monofiletikus vonalat képeztek, míg 24 szerovár polifiletikus volt, mindegyik 2-4 vonalból állt. Ezen szerovárok közül többről ismert, hogy polifiletikus, és nem valószínű, hogy szerovár-specifikus génmarkereket tartalmaz (Falush et al., 2006; den Bakker et al., 2011; Achtman et al., 2012; Timme et al., 2013). Az Enteritidis szerovár parafiletikus három másik szerovárral (Dublin, Berta és Gallinarium), amelyek a nagyobb Enteritidis kládból származnak, amely maga is három törzsből áll, amelyek a, B és C kládként ismertek (Graham et al., 2018). Az öt Enteritidis-specifikus jelölt génmarkerek negatívak voltak az Enteritidis izolátumokkal szemben, amelyek külön csoportosultak a fán.

érdekes módon négy polifiletikus szerovár, a Bredeney, a Kottbus, a Livingstone és a Virchow esetében mindegyiknek volt egy jelölt szerovár-specifikus génje, amely jelen volt a szerovár összes izolátumában. A fennmaradó 20 polifiletikus Szerovár és parafiletikus Szerovár Enteritidis esetében származásspecifikus génmarkereket kerestünk, mivel minden szerovár egynél több származékot tartalmazott. Ha minden nemzetség tartalmazott legalább egy származás-specifikus gént, akkor ezt a szerovárt szerovár-specifikus génmarkereknek tekintjük. Összesen 111 potenciális származás – specifikus génmarkereket azonosítottak 19 polifiletikus szerovárra és parafiletikus Szerovár Enteritidisre, amelyek közül 27 származás-specifikus génmarkereket azonosítottak 5 100%-os specificitású és érzékenységű szerovárra (nincs FN és FP), 76 jelölt származás-specifikus génmarkereket 14 100% – os érzékenységű és 100% – nál kisebb specificitású szerovárra (változatos FP), valamint 6 jelölt származás-specifikus génmarkereket tartalmazó Enteritidist változatos Fn és FP (táblázat 1).

a 11 A 82 monofiletikus szerovárok, amelyek hiányoztak szerovár-specifikus jelölt gén markerek miatt FN, azt találtuk, hogy az FN gyakran volt köszönhető, hogy izolátumok, amelyek csoportosítva az egyik ága, és eltérnek korábban a többi izolátum. Az ilyen csoportok esetében lineage-specifikus génmarkereket kerestünk. Ezért két vagy több génmarkerrel azonosítható egy szerovár, és az ilyen szerovárokat úgy tekintették, hogy szerovár-specifikus génmarkereket tartalmaznak, hasonlóan a polifiletikus szerovárokhoz. Három szerovárt, a Paratyphi A-t, a Heidelberget és a Muenchent lehetett azonosítani a származásspecifikus génmarkerekkel.

összesen 414 jelölt szerovár-specifikus génmarkereket, köztük 295 szerovár-specifikus génmarkereket és 119 származás-specifikus génmarkereket foglalunk össze az S2 kiegészítő táblázatban. Összesen 106 107 szerovár tartalmazott egy vagy több génmarkereket, 33 szerovár tartalmazott egy specifikus gént, míg 73 tartalmazott két vagy több génmarkereket. Nem találtak jelölt szerovár-specifikus génmarkereket a monofiletikus Typhi számára, és nem találtak potenciális lineage-specifikus génmarkereket a Stanleyville III lineage számára, amely csak egy izolátumot tartalmazott.

A Szerovár-specifikus Génmarkerek funkcionális kategóriái

mind a 414 génmarker funkcionális jellemzése, amelyeket a 106 szerovár esetében azonosítottak a RAST segítségével, azt találták, hogy 197 ismert funkcióval rendelkezik, 217 pedig ismeretlen funkcióval rendelkező hipotetikus fehérjéket kódolt. Csak 46 kommentált gén csoportosítható funkcionális kategóriákba, míg 151 funkcióval rendelkező gén nem volt a Rast funkcionális kategóriáiban (2.táblázat). Faszter használata. 45 jelölt szerovár-specifikus génmarkereket találtak az előre jelzett próféciákban.

minimális Szerovár-specifikus Génmarkerek az In silico molekuláris Szerotipizáláshoz

sok szerovár esetében több jelölt szerovár-specifikus génmarkereket vagy lineage-specifikus génmarkereket azonosítottak. Ezekben az esetekben egyetlen gént választottak ki, amelynek a legalacsonyabb az FN és az FP aránya. Legalább 131 génmarkerek lehetővé teszik a szerovárok azonosítását 0-8, 33% hibaaránnyal. A génmarkerek eloszlása mind a 106 szerovárban nagyfokú specifitást mutat, amint azt a 2.ábra mutatja, amelyben az átló a szerovár vagy a származás egy-egy kapcsolatát mutatja a szerovár-specifikus génmarkerekkel, míg az átlós tér ritkán szétszórt jelenlétét mutatta ezeknek a géneknek más szerovárokban, változó százalékos arányban, alacsony FPR-t jelezve. Ezeknek a génmarkereknek a részleteit az S4 kiegészítő táblázat sorolta fel. Összességében 45 szerovárt lehet megkülönböztetni a saját szerovár-specifikus génjük alapján, 61 szerovárt pedig génmarkerek kombinációjával lehet megkülönböztetni.

további 1089 genomot teszteltünk, amelyek 106 nem tífuszos szalmonella szerovárhoz tartoznak annak értékelésére, hogy a 131 specifikus génmarkerek képesek-e helyesen hozzárendelni a szerovarokat az izolátumokhoz. A szerovár-specifikus génmarkerek segítségével az 1038 1089 izolátumból (95,3%) sikerült hozzárendelni, 51 pedig sikertelen (4,7%). A SISTR és a SeqSero esetében az egyező szerovár-hozzárendelések száma sorrendben 1037 (95%), illetve 905 (82,8%) volt (S3 kiegészítő táblázat).

Szerovár-specifikus Génmarkerek a közönséges Szerovárok Szerotipizálásához

az egyes kontinenseken található emberi fertőzést okozó 20 legfontosabb szerovár (Hendriksen et al., 2011) 46 szerovár kombinált listájára összeomlottak (S5 kiegészítő táblázat). Mivel ezek a szerovárok az izolátumok túlnyomó többségét tartalmazták, amelyek globálisan emberi fertőzéseket okoztak, külön vizsgáljuk őket, hogy felmérjük a jelölt szerovár-specifikus génmarkerek hasznosságát a legelterjedtebb szerovárok szerotipizálásához helyi körülmények között. Amikor csak ezeket a szerovarokat vették figyelembe, 18 kívül 46 egyedileg azonosítható az egyik szerovár-specifikus génmarkerrel. A gépelés pontosságának növelése a fennmaradó 28 gyakori szerovárban, ahol a szerovár-specifikus génmarkerek változtak az FPRs-ben, a 131 génmarker részhalmazainak felhasználásával vizsgáltuk (szerováronként 2-9 gén között) a potenciális FP kiküszöbölésére. Például a Choleraesuis specifikus gén és a Cerro-I származás-specifikus gén kombinációja kiküszöbölheti a Cerro hamis pozitív izolátumát a Choleraesuis – ból, ha mindkét gén pozitív, az izolátum Cerro-hoz rendelhető, míg ha a Cerro-I származás-specifikus gén negatív, az izolátum Choleraesuis.

a gépelés lehetséges hibáinak becsléséhez figyelembe vettük a 46 gyakori szerovár gyakoriságát, amelyek nagy különbségeket mutattak a régiók között (Hendriksen et al., 2011). Ezért a gének különböző kombinációi alkalmazhatók az adott régióban jelen lévő szerovárok hamis pozitív eredményeinek specifikus korlátozására. Egy adott régióban a közös jelölt szerovár-specifikus génmarkerek specificitását az FP sebességével és az adott régióban a hamis pozitív szerovár gyakoriságával számítottuk ki. A jelölt szerovár-specifikus génmarkerek specifitását az FP arány alkalmazásával is kiszámítottuk (S4 kiegészítő táblázat). Például egy 15 génből álló panel használható a 10 leggyakoribb szerovár beírására Ausztráliában (NEPSS 2010) (3.táblázat). Az Ausztrál regionális gyakoriságot figyelembe véve a 3.táblázatban felsorolt gének használhatók markerként a laboratóriumi alapú tipizáláshoz, és a hibaarány kevesebb, mint 2,4%.

megbeszélés

A szalmonella szerotipizálása létfontosságú volt a diagnózis és a megfigyelés szempontjából. A hagyományos szerotipizálással végzett szerovár-előrejelzést korlátozhatja a felszíni antigén expresszió vagy az autoagglutinációs tulajdonságok hiánya (Wattiau et al., 2008). A közelmúltban a teljes genom szekvenálási technológia kifejlesztésével az rfb géncsoport o antigénre vonatkozó Genom régiói, a Flic gén és a H antigénekre vonatkozó fljb gén, valamint az MLST által megcélzott gének kivonhatók és felhasználhatók a szerovár azonosítására. Számos tanulmány azonosította a szerovár-specifikus géneket vagy DNS-fragmenseket a szerotipizáláshoz a teljes genom szekvenálásán alapuló genomi összehasonlítás révén (Zou et al., 2013, 2016; Laing et al., 2017). Ezek a szerovár-specifikus gének vagy DNS-fragmensek azonban csak kis számú szerovárt különböztettek meg. Ebben a tanulmányban 414 jelölt szerovár-specifikus vagy származás-specifikus génmarkereket azonosítottunk 106 szerovár esetében, amelyek 24 polifiletikus szerovárt és a parafiletikus Szerovár Enteritidist tartalmaznak. Ezeknek a génmarkereknek egy részét független genomok validálták, és az esetek 95,3% – ában képesek voltak helyesen hozzárendelni a szerovarokat.

a fenti elemzést bonyolította a polifiletikus szerovárok jelenléte, amelyek különálló ősektől függetlenül keletkeznek, hogy külön vonalakat képezzenek. Ezért a származás-specifikus génmarkerek kombinációjára volt szükség a polifiletikus szerovárok többségének egyértelmű azonosításához. Érdekes módon négy polifiletikus szerovár, a Bredeney, a Kottbus, a Livingstone és a Virchow mindegyikének volt egy jelölt szerovár-specifikus génmarkere, amely jelen volt a szerovár összes izolátumában. Az előrejelzések szerint a Bredeney szerovár-specifikus gén az O antigén konverzióban részt vevő transzlokázt kódolja, és ezzel párhuzamosan nyerhető is. A másik három polifiletikus szerovár szerovár-specifikus génjei ismeretlen funkciójú hipotetikus fehérjéket kódolnak, és nincs nyilvánvaló magyarázat ugyanazon szerovár különböző vonalaiban való jelenlétükre.

a polifiletikus Szerovárokkal ellentétben az Enteritidis parafiletikus szerovár három ágának (a, B és C klád) közös közös őse van. Korábbi tanulmányok leírták, hogy az Enteritidist a Dublin, A Berta és a Gallinarium szerovarokkal csoportosították, amelyeket “enteritidis szekciónak” neveztek (Vernikos et al., 2007; Achtman et al., 2012; Allard et al., 2013; Timme et al., 2013). Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a szerovár Nitra beágyazódott Enteritidis vonalak felhasználásával teljes genom filogenitás (Deng et al., 2014). Az Enteritidis és a Nitra között is volt keresztreaktivitás Ogunremi tanulmánya szerint (Ogunremi et al., 2017). Vizsgálatunkban az izolátumokat az RST-k alapján választottuk ki, a Nitra nem volt jelen az Enterobase rMLST adatbázisban, amikor ez a tanulmány megkezdődött, ezért nem szerepelt ebben a tanulmányban. A gallinárium megkülönböztethető az Enteritidis-től a 4 bp deléció a speC génben (Kang et al., 2011). Megfigyeltük, hogy a Dublin, A Berta és a Gallinarium szerovárok közös ősei a B és az A/C kládok közötti ősből származnak.bár Dublin külön azonosítható, nem tudjuk megkülönböztetni a Berta vagy a Gallinarium kládot az Enteritidis a/C kládtól. ezek az eredmények rámutatnak a megközelítés korlátozására, mivel a szerovároknak kellően eltérőnek kell lenniük ahhoz, hogy legalább egy egyedi génben különböznek egymástól. Hasonlóképpen, ott volt 8 más szerovárok, amelyek valószínűleg nem voltak megkülönböztethetők a legutóbbi közös ősök miatt, kevés génszerzéssel.

Szerovár-specifikus jelölt génmarkerek vagy lineage-specifikus jelölt génmarkerek 69-ből 106 szerovárok voltak összefüggő a genomban hasonló funkciók csoportosítva (az adatok nem láthatók). Ez arra utal, hogy ezek a génmarkerek horizontális géntranszfer révén együtt beépülhettek a szerovár genomokba. Valójában a hét typhimurium specifikus jelölt génmarkerek azonosított ebben a vizsgálatban (STM4492, STM4493, STM4494, STM4495, STM4496, STM4497, és STM4498) található typhimurium tRNAleuX integráló konjugatív elem kapcsolatos régióban, beleértve a gének STM4488 STM4498, amely egy ismert horizontális géntranszfer hotspot (Bishop et al., 2005). Hasonlóképpen öt Enteritidis specifikus jelölt génmarkereket azonosítottak (SEN1379, SEN1380, SEN1382, SEN1383 és SEN1383) az Sdr i régióban (Agron et al., 2001), valamint a profága-szerű gei/xhamse14 régió (Santiviago et al., 2010). Mindkét régió a profágokhoz kapcsolódik, ami arra utal, hogy ezek a régiók integrálódtak a globális Enteritidis klád közös ősének genomjába, és horizontális géntranszferből származtak.

Az in silico szerovár előrejelzésének egyéb módszereit a SeqSero-ban valósítják meg (Zhang et al., 2015) és SISTR (Yoshida et al., 2016). Mindkét módszer megvizsgálja a felszíni antigénekért felelős genomi régiókat, míg a SISTR cgMLST sémát is alkalmaz az általános genetikai rokonság vizsgálatára. Továbbá, a hagyományos 7 gén MLST és eBURST csoportok származtatott belőle is használható in silico szerovár meghatározása (Achtman et al., 2012; Ashton et al., 2016; Robertson et al., 2018). Mind a SISTR, mind a SeqSero nagyobb diszkriminatív teljesítményt nyújt, mint a hagyományos szerovár-azonosítás (Yachison et al., 2017). Számos hátrányuk van azonban, például megkülönböztethetetlen szerovárok, amelyek azonos antigén képlettel rendelkeznek, vagy antigén determinánsok nem expresszálódnak (Robertson et al., 2018). A jelenlegi tanulmányban in silico szerovár-előrejelzést vizsgáltunk a genomok szűrésével 131 szerovár-specifikus génmarkerkészlet ellen. A megközelítés szerovár-előrejelzést adott az egyes szerovár-specifikus génmarkerek “jelenlétének vagy hiányának” megadásával vagy génmarkerek kombinációjával egy lekérdezési izolátumban. Megmutattuk, hogy a szerovár-specifikus génmarkerek hasonló pontossággal rendelkeznek más In silico szerotipizálási módszerekkel, 91,5% – os izolátumokkal a kezdeti azonosítási adatkészletből és 84,8% – os izolátumokkal a megfelelő szerovárhoz rendelt validációs adatkészletből (FN és FP nélkül). 10.A validációs adatkészletből származó izolátumok 5% – a hozzárendelhető a megfelelő szerovárt tartalmazó szerovárok kis részhalmazához (változatos FP-vel). A szerovár-specifikus génmarkerek in silico szerovár predikciós megközelítésének specificitása 95,3% volt, valamivel magasabb, mint a SISTR (95%) és a SeqSero (82,8%) ugyanazon adatkészletben, amelyet teszteltünk. Ez az eredmény hasonló volt a SISTR és a SeqSero sajátosságaihoz, amelyeket Yachison et al. (2017), amelyek 94,8, illetve 88,2% voltak.

szerovár-specifikus génmarker alapú módszerünk nem igényli az O antigén géncsoportok pontos vizsgálatát vagy a H antigén gének szekvenciaváltozását, ami problémás lehet. Módszerünk enyhíti a teljes gén vagy genomszekvencia összeállításának szükségességét is, amely MLST vagy cgMLST alapú módszerekben szükséges. Ezért ez a megközelítés hasznos lehet olyan esetekben, amikor nagyon kevés szekvencia áll rendelkezésre, például metagenomikában vagy kultúramentes gépelés, valamint harmadik alternatíva biztosítása más elemzések megerősítésére.

a fejlesztési molekuláris vizsgálatokban hasznos lehet egy olyan génmarkerkészlet azonosítása is, amely képes egy régió összes elterjedt szerovárjának egyedi azonosítására. Ezek a vizsgálatok hasznosak lennének olyan izolátumok szerotipizálásában, ahol a tenyészeteket már nem nyerik, ezért a hagyományos szerotipizálás lehetetlen. Például olyan PCR-vizsgálatokat lehet megtervezni, amelyek lehetővé teszik a specifikus génmarkerek érzékeny kimutatását, ezért lehetővé teszik a szerovár előrejelzését egy klinikai mintából. Továbbá, kiküszöbölve a régióban nagyon ritkán megfigyelt szerovarok kimutatásának szükségességét, ezeknek a génmarkereknek a száma, amelyek a régió összes fő szerovárjának kimutatásához szükségesek, jelentősen csökkenthető, lehetővé téve a költséghatékonyabb vizsgálatot.

következtetés

ebben a tanulmányban 106 szerovár jelölt szerovár-specifikus génmarkereit és jelölt származás-specifikus génmarkereit azonosítottuk azáltal, hogy 2258 törzs reprezentatív szelekciójának kiegészítő genomjait jellemeztük az In silico szerotipizálás potenciális markereként. Figyelembe vesszük a polifiletikus és parafiletikus szerovarokat, hogy új módszert biztosítsunk ezen génmarkerek jelenlétének vagy hiányának felhasználásával, hogy megjósoljuk az izolátum szerovárját a genomi adatokból. Az itt azonosított génmarkerek felhasználhatók szerotipizáló vizsgálatok kifejlesztésére izolált törzs hiányában is, amelyek hasznosak lesznek, mivel a diagnózis a tenyészet független és metagenomikus módszerekre mozog.

szerzői hozzájárulások

MP és RL tervezte a tanulmányt, és biztosította a kézirat kritikai felülvizsgálatát. Az XZ és az MP elvégezte a bioinformatikai elemzést. XZ, MP és RL elemezte az eredményeket. XZ elkészítette a kéziratot.

finanszírozás

Ez a munka támogatta a Nemzeti Egészségügyi és Orvosi Kutatási Tanács projekt támogatás.

összeférhetetlenségi nyilatkozat

a szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.

Kiegészítő anyag

A cikk kiegészítő anyaga megtalálható az interneten:: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.00835/full#supplementary-material

S1 ábra | a ParSNP által felépített SNP-alapú filogenetikai fa, amely 1344 reprezentatív izolátum, köztük 1258, a vizsgálatban vizsgált 107 szerovárból származó izolátum és 86, a vizsgálatból egyébként kizárt, 5 RST-nél kisebb szerovárból származó izolátum felhasználásával mutatja az evolúciós kapcsolatokat a Szerovárokon belül és azok között.

táblázat S1 | a végső adathalmaz 2258 kiváló minőségű és következetes szerovár prediktív genomok képviselő 107 szerovár.

táblázat S2 | összesen 414 jelölt szerovár – specifikus gén, köztük 295 szerovár-specifikus gén és 119 származás – specifikus gén.

táblázat S3 | további 1089 validációs izolátumok SZEROVÁR predikciós eredményekkel SISTR, SeqSero és szerovár-specifikus génmarkerekkel.

táblázat S4 | legalább 131 gén 106 szerovár azonosításához.

S5 táblázat | 65 génkészlet 46 közös szerovár azonosításához.

ADATOK S1 | 131 szerovár-specifikus génmarkerek szekvenciái.

rövidítés

FN, hamis negatív; FP, hamis pozitív; FPR, hamis pozitív arány; MLST, multi-locus szekvencia tipizálás; NEPSS, Nemzeti enterális kórokozók felügyeleti rendszere; PPV, pozitív prediktív érték; rSTs, riboszomális MLST STs; SISTR, Salmonella in silico gépelési erőforrás; TN, igaz negatívok; TNR, igaz negatív arány; TP, igaz pozitív; TPR, igaz pozitív arány.

Footnotes

1. ^ https://www.ebi.ac.uk/ena
2. ^ http://bioinf.spbau.ru/spades
3. ^ http://bioinf.spbau.ru/quast
4. ^ http://github.com/marbl/harvest
5. ^ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
6. ^ http://rast.theseed.org/FIG/rast.cgi