2.1 anaerob légzés

a légzés során a membránhoz kapcsolódó különböző dehidrogenázok oxidálják a vízben oldódó szubsztrátumokat, és a menakinont (MK) a membránban menakinollá redukálják. Aerob körülmények között az elektronokat az oxigén vízre redukálására használják, míg anaerob körülmények között a nitrát légzési növekedési elektronjai nitrátba kerülnek, hogy nitritet kapjanak (ábra. 5.1). A légzés egyik fő elektrondonora a glikolízis és a trikarbonsav ciklus során keletkező NADH+H+. A membránhoz kötött NADH dehidrogenázok két típusát, az NDH-I-t és az NDH-II-t írták le a baktériumok számára, hogy katalizálják a NADH+H+ oxidációját NAD+ – ra (Yagi, 1993). Az NDH-I 14 alegységből áll, amelyeket a nuo operon kódol az Escherichia coli-ban, és flavin mononukleotidot (FMN) és számos vas–kén klasztert tartalmaz, amelyek összekapcsolják az elektrontranszfert a membránon keresztül történő protonpumpálással. Az NDH-II egyetlen alegységből áll, amelyet az ndh gén kódol. Az NDH-II nem integrált membránfehérje, hanem a citoplazmatikus membrán belső oldalához kapcsolódik. Flavin-adenin-dinukleotidot (fad) tartalmaz protetikai csoportként, és az elektrontranszfer nem kapcsolódik proton transzlokációhoz. A B. subtilis genomban három gén, az yjlD, a yumB és a yutJ kódolja az NDH-II típusú NADH-dehidrogenázokat, míg a nuo operon hiányzik a B. subtilis genomból (Kunst et al., 1997). Az Ndh névre keresztelt YjlD 392 aminosavmaradékból áll, és 29%-os szekvenciaazonosságot mutat az E. coli NDH-II-vel (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Érdekes módon a B Ndh fehérje mennyisége. a subtilis szignifikánsan csökkent anaerob körülmények között (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Úgy tűnik, hogy az Ndh a B. subtilis fő aerob NADH dehidrogenáza, mivel az ndh gén mutációja aerob növekedési hibát mutatott (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Eközben kimutatták, hogy az yjlC-ndh operon expresszióját a Rex szabályozó, egy redox-érzékelő transzkripciós szabályozó szabályozza, amely reagál a NADH/NAD+ arányra (Lásd még a 3.3.szakaszt) (Gyan et al., 2006). Ezzel szemben a yumb gén expresszióját nitrát légzési körülmények között indukálták transzkriptóm vizsgálatokban (E. H!, publikálatlan eredmények). Meg kell határozni, hogy a YumB és a YutJ rendelkezik-e NADH-dehidrogenáz aktivitással, amint azt a fehérjeszekvencia-hasonlóság sugallja, és hogy ezek relevánsak-e nitrát légzési növekedési körülmények között.

a többi aerob lélegző organizmushoz hasonlóan a B. subtilis szukcinát-dehidrogenázzal (sdh) vagy pontosabban szukcináttal rendelkezik:kinon-oxidoreduktáz, SQR (H Xhamgerh Xhamll, 1997). Az enzimkomplex a baktériumok citoplazmatikus membránjának, az eukarióták belső mitokondriális membránjának szerves része. Katalizálja a szukcinát fumaráttá történő oxidációját a kinon redukciójával párosítva. Ezáltal az enzim funkcionális része mind a citromsavciklusnak, mind a légzési Láncnak (H! – GH. – H! – GH. – H! – H! – H! – H! – H! – H! – H! – H! – H! – H! – Hederstedt, 1992). Az SQR a B. subtilis-ben csökkenti az MK-t, és három fehérje alegységgel rendelkezik: SdhA, SdhB és SdhC. Az SdhA egy flavoprotein, amelynek egy kovalensen kötött hóbortja van, amely a szukcinát két elektron-oxidációját fumaráttá teszi a citoplazmában. Az SdhB három vas–kén klasztert (, , and ) tartalmaz, amelyek az SdhC-ben a citokróm b558 flavincsoport és B hem közötti elektronátvitelben működnek. Az SdhC-nek öt transzmembránja van! – spirális szegmensek és rögzíti az SdhAB dimert a membrán citoplazmatikus oldalán, és a transzmembrán elektronátvitelben működik MK-ba (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoy, Aasa, & Hederstedt, 2000). A két hem b kofaktor közvetíti az elektronok átvitelét a citoplazmatikus membránon keresztül a membrán külső oldalára, ahol az MK redukálódik és két protont fogyasztanak (Hederstedt, 2002). Ez különbözik az E. colitól, ahol az ubiquinon ubiquinollá történő redukciójának protonjait a membrán negatív oldalán fogyasztják, ami nem befolyásolja a membránpotenciált. B. a subtilis és más bacillusok, mint például a Bacillus megaterium és a Bacillus cereus törzsek oxikus körülmények között növekedhetnek szukcinát szén-és energiaforrásként (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

a B. subtilis, a B. megaterium és a B. cereus nem nő anaerob körülmények között glicerin jelenlétében. Egyetértésben a glicerin-3-dehidrogenáz génjei hiányoznak a genomokban. A membrán lokalizált elektrontranszfer-rendszer aerob variánsának glpD génjét azonban a B. subtilis-ben detektáltuk. Nem találtak homológiát az E. coli-ban jelen lévő egyéb primer dehidrogenázokat kódoló géneknél, például különféle formiát-dehidrogenáz, hidrogénázok, l-laktát-dehidrogenáz, d-aminosav-dehidrogenáz, malát:kinon-oxidoreduktázok vagy a kinoprotein glükóz-dehidrogenáz. Nyilvánvaló, hogy a B. subtilis csak korlátozott számú primer elektron-adományozó dehidrogenázzal rendelkezik, nevezetesen az NDH-II és az aerob glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz különféle formáival.

aerob körülmények között az elektronok a menakinolból a citokróm bc1 komplexen keresztül jutnak át az aa3 típusú citokróm c-oxidázba. Mikroaerofil állapotban a magas oxigén affinitású citokróm BD típusú menakinol-oxidázt alkalmazzák. A fumarátot mint terminális elektron akceptort kizárták a különféle bacillusok, köztük a B. subtilis esetében (Schirawski & Unden, 1995). Következésképpen a fumarát-reduktáz génjei nem találhatók meg a B. subtilis genomban. Más Bacillus törzsek, mint például a Bacillus licheniformis és a Bacillus circulans, belélegezhetik a fumarátot, mint az E. coli.

anaerob növekedési körülmények között a B. subtilis az elektronokat kizárólag a légzőszervi nitrát-reduktázba továbbítja. A baktériumokban három különböző nitrát-reduktáz rendszert osztályoznak: a citoplazmatikus asszimilációs NAD (P)H-függő nitrát-reduktázokat (NAS), a membránhoz kötött légúti nitrát-reduktázt (Nar) és a periplazmás disszimilációs nitrát-reduktázokat (Nap). Mindhárom a DMSO reduktáz fehérjecsaládjába tartozik, és tartalmazza a bisz-molibdopterin guanin-dinukleotid (MGD) kofaktort (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). A B. subtilis Genom csak a légzőszervi nitrát-reduktáz Nar-t kódolja. A Nar enzimek általában három alegységből állnak. A nagy NarG alegység tartalmazza az aktív helyet az MGD kofaktorral, egy kisebb oldható NarH alegység egy és három központot tartalmaz, a NarI alegység pedig citokróm b. a Nar egy kinol-oxidáz, a menakinol-medencét pedig a Nari citokróm b alegység oxidálja. Két elektron áramlik a Nari B hemén keresztül a NarH vas-kén klasztereibe, végül a narg citoplazmatikus alegységbe, amely a nitrátot nitritté redukálja. A NarJ fehérje nem része az enzimnek, de szükséges a membránhoz kötött enzim végső összeszereléséhez (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). A periplazmában a kinol oxidációjának és a citoszol nitrát redukciójának különböző helyei miatt a nitrát-reduktáz Nar hozzájárul a protongradiens kialakulásához (ábra. 5.1). A nar lokusz a narghji operonból (légzési nitrát-reduktáz kódolása), a narK-ból (egy potenciális nitrit extrudáló fehérje esetében), az ywic nyitott leolvasási keretből (ismeretlen funkciójú), az anaerob légzés és fermentáció modulátorát kódoló arfM-ből, valamint az anaerob szabályozó FNR génjéből áll (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

a nitritet ezután az asszimiláló nitritreduktáz NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Asszimiláló vagy ammónium-termelő NADH-függő nitrit-reduktáz egy siroheme-tartalmú enzim, amely katalizálja a hat elektron redukció nak, – nek nitrit ammónium. A nasde nitrit-reduktáz gének egy nasDEF operon részét képezték, és közvetlenül a NASBC operon után találhatók, amely a NADH-függő nitrát-reduktázt kódolja (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).