az RNase H aktiválása

az RNase H mindenütt jelen lévő enzim, amely lebontja az RNS–DNS duplex RNS-szálát. Olyan organizmusokban azonosították, mint a vírusok és az emberi sejtek (Crouch and Dirksen, 1985). Az eukarióta sejtekben legalább két RNáz h osztályt azonosítottak. Több RNáz h aktivitású enzimet figyeltek meg prokariótákban (Crouch and Dirksen, 1985). Bár az RNáz H részt vesz a DNS replikációjában, más szerepet játszhat a sejtben, és megtalálható a citoplazmában, valamint a magban (Crum et al., 1988). Úgy gondolják azonban, hogy az enzim koncentrációja a magban nagyobb, és a citoplazmatikus készítményekben található enzim egy része a nukleáris szivárgás következménye lehet.

az RNase h pontos felismerési elemei nem ismertek. Kimutatták azonban, hogy a DNS-szerű tulajdonságokkal rendelkező oligonukleotidok, olyan rövidek, mint a tetramerek, aktiválhatják az RNáz H-T (Donis-Keller, 1979). A cukor változásai befolyásolják az RNáz H aktiválódását, mivel a cukor olyan módosításai, amelyek RNS-szerű oligonukleotidokat eredményeznek, pl. 2 ‘- fluoro vagy 2 ‘ – Metoxi úgy tűnik, hogy nem szolgálnak az RNáz H szubsztrátjaként (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). A cukor bázishoz való orientációjának megváltozása szintén befolyásolhatja az RNáz H aktiválódását, mivel az oligonukleotidok nem képesek indukálni az RNáz H-t, vagy párhuzamos lágyítást igényelhetnek (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Ezenkívül a gerincmódosítások befolyásolják az oligonukleotidok azon képességét, hogy aktiválják az RNáz H-T. A metilfoszfonátok nem aktiválják az RNáz H-T (Maher et al., 1989; Miller, 1989). Ezzel szemben a foszforotioátok kiváló szubsztrátok (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein and Cheng, 1993). Ezenkívül a kiméra molekulákat oligonukleotidokként vizsgálták, amelyek kötődnek az RNS-hez és aktiválják az RNáz H-T (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Például a 2’-Metoxi-foszfonátok szárnyaiból és a dezoxioligonukleotidok öt bázisréséből álló oligonukleotidok kötődnek a cél RNS-hez és aktiválják az RNáz H-T (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Továbbá kimutatták, hogy a dezoxiribonukleotidok szekvenciájában egyetlen ribonukleotid elegendő ahhoz, hogy szubsztrátként szolgáljon az RNáz H számára, ha komplementer dezoxi-oligonukleotidjához kötődik (Eder and Walder, 1991).

azt is kimutatták, hogy lehetséges az RNáz H aktiválására tervezett kiméra oligonukleotidok előnyeinek kihasználása, nagyobb affinitással rendelkeznek RNS-receptoraikhoz és fokozzák a specifitást (Giles and Tidd, 1992; Monia et al., 1993). Egy vizsgálatban a cél transzkriptum RNáz-H által közvetített hasítása sokkal szelektívebb volt, amikor a metil-foszfonát-dezoxioligonukleotid szárnyakból és foszfodiészter-résekből álló dezoxioligonukleotidokat teljes foszfodiészter-oligonukleotidokkal hasonlították össze (Giles and Tidd, 1992).

az RNáz H-ról szóló információk és annak bizonyítása ellenére, hogy sok oligonukleotid aktiválhatja az RNáz H-t a lizátumban és a tisztított enzimvizsgálatokban, viszonylag keveset tudunk az RNS-célpontok szerkezeti jellemzőinek szerepéről az RNáz H aktiválásában (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder és Walder, 1988). Valójában a legutóbbi időkig hiányzott a közvetlen bizonyíték arra, hogy az RNáz H aktiválása valójában az oligonukleotidok hatásmechanizmusa a sejtekben.

laboratóriumainkban végzett legújabb tanulmányok további, bár közvetett betekintést nyújtanak ezekbe a kérdésekbe. Az ISIS 1939 egy 20 mer foszforotioát, amely kiegészíti az ICAM-1 RNS 3′-nem lefordított régiójában lévő szekvenciát (Chiang et al., 1991). Gátolja az ICAM termelést az emberi köldökvénás endothel sejtekben, és az Északi blotok azt mutatják, hogy az ICAM-1 mRNS gyorsan lebomlik. Az ISIS 2′-Metoxi analógja 1939 nagyobb affinitást mutat az RNS iránt, mint a foszforotioát, stabil a sejtekben, de sokkal kevésbé hatékonyan gátolja az ICAM-1 fehérjetermelést, mint az ISIS 1939. Valószínű, hogy az ISIS 1939 destabilizálja az RNS-t és aktiválja az RNáz H-t.ezzel szemben az ISIS 1570, egy 18-mer foszforotioát, amely kiegészíti az ICAM-1 üzenet transzlációs iniciációs kodonját, gátolta a fehérje termelését, de nem okozta az RNS lebomlását. Így két oligonukleotid, amelyek képesek aktiválni az RNáz H-t, eltérő hatással volt az mRNS azon helyétől függően, amelyhez kötődtek (Chiang et al., 1991). Közvetlenebb demonstrációt arról, hogy az RNáz H valószínűleg kulcsfontosságú tényező számos antiszensz oligonukleotid aktivitásában, olyan vizsgálatok szolgáltattak, amelyekben reverz ligációs PCR-t alkalmaztak a bcrabl mRNS hasítási termékeinek azonosítására foszforotioát oligonukleotidokkal kezelt sejtekben (Crooke et al., 1995).

tekintettel a kiméra oligonukleotidok kialakulóban lévő szerepére a 3′- és 5′-szárnyak módosításával, amelyek célja a cél RNS és nukleáz stabilitás iránti affinitás fokozása, valamint egy DNS-típusú rés, amely szubsztrátként szolgál az RNáz H számára, a különféle módosítások hatásának megértésére összpontosító vizsgálatok az enzim(ek) hatékonyságára szintén jelentős jelentőséggel bírnak. Az E. coli RNáz H-val végzett egyik ilyen vizsgálatban beszámoltunk arról, hogy az enzim minimális szekvenciaspecifitást mutat, és processzív. Amikor a szárnyakban 2′- módosított cukrokkal rendelkező kiméra oligonukleotidot hibridizáltuk az RNS-szel, a hasítás kezdeti helye az RNS-szubsztrát 3′ – végéhez legközelebb eső metoxi-dezoxi csomópont melletti nukleotid volt. A hasítás kezdeti sebessége a DNS-rés méretének növekedésével nőtt, és az enzim hatékonysága lényegesen kisebb volt egy kiméra antiszensz oligonukleotiddal duplexált RNS-célponttal szemben, mint egy teljes DNS-típusú oligonukleotiddal (Crooke et al., 1995).

a későbbi vizsgálatokban az antiszensz oligonukleotidok kölcsönhatásait strukturált és strukturálatlan célpontokkal, valamint ezeknek a kölcsönhatásoknak az RNase H-ra gyakorolt hatását részletesebben értékeltük (Lima és Crooke, 1997). Egy sor nem hasítható szubsztrát és Michaelis-Menten analízis segítségével mind a kötést, mind a hasítást értékelni tudtuk. Megmutattuk, hogy valójában az E. coli RNáz H1 Egy kettős szálú RNS-kötő fehérje. Az RNS-duplex KD-je 1,6 fő volt, a DNS-duplex Kd-je 176 fő, az egyszálú DNS Kd-je pedig 942 fő volt. Ezzel szemben az enzim csak RNS-DNS duplexben képes hasítani az RNS-t. A hasítás helyén az antiszensz gyógyszer bármely 2′-módosítása gátolta a hasadást, de a kötési helyen a töltés jelentős csökkenése és a 2′-módosítások toleráltak voltak. Végül pozitív töltés (pl. 2′-propoxiamin) elhelyezése az antiszensz gyógyszerben csökkentette az affinitást és a hasadást. Megvizsgáltuk az antiszensz oligonukleotid által indukált RNS struktúrák hatását az E. coli RNáz h1 aktivitására (Lima and Crooke, 1997). Megállapítottuk, hogy a duplex szubsztrát bármely szerkezete jelentős negatív hatással van a hasítási sebességre. Továbbá a kiválasztott helyek hasítása teljesen gátolt volt, amit a kisebb vagy nagyobb barázdákon vagy a heteroduplex-en áthaladó RNS-hurok által okozott szterikus akadály magyarázott. Nemrég klónoztuk és expresszáltuk a humán RNáz H1-et. A fehérje homológ az E. coli RNáz H1-hez, de tulajdonságai hasonlóak a humán RNáz H 2-es típusához leírtakhoz (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). Az enzimet az Mg2 + alacsony koncentrációja stimulálja, a magasabb koncentrációk gátolják, az Mn2+ pedig Mg2+jelenlétében gátolja. Molekulatömege 33 kDa. Kettős szálú RNS-kötő fehérje, és egyedi pozíciós és szekvencia-preferenciákat mutat a hasításhoz (Wu et al., 1999). Ezenkívül a humán RNáz H2-t klónozták, de a mai napig az expresszált fehérje nem bizonyult aktívnak (Frank et al., 1998). Nemrégiben beszámoltunk a humán RNáz H1-be bevezetett számos mutáció hatásáról az enzim aktivitására (Wu et al., 2000). Így most már megvannak a szükséges eszközök ahhoz, hogy elkezdjük feltárni az emberi RNáz H szerepét a biológiai és farmakológiai folyamatokban, és elkezdjük kifejleszteni azokat a gyógyszereket, amelyek hatékonyabban hatnak rájuk.

végül, legalábbis a célzott RNS RNáz h-indukált lebomlása tekintetében, nemrégiben bebizonyítottuk, hogy az RNS sejtenként 1-150 kópia tartományában a cél RNS szintje nincs hatással az antiszensz inhibitorok hatékonyságára (Miraglia, 2000). Ennek oka az a tény, hogy az antiszensz gyógyszer molekuláinak száma sejtenként több nagyságrenddel meghaladja az RNS másolatainak számát. Így más tényezőknek sebességkorlátozónak kell lenniük.