az emlőssejtekbe történő géntranszfer rendkívül hatékony módszere a retrovírus vektorokkal történő fertőzés. A retrovírus fertőzés hatékonysága jelentősen, egyes sejtekben 100-1000-szeresére nő, a fertőzés során a polibrént is beleértve. A DMSO sokkkal rendelkező polibrént arra is használják, hogy közvetítse a DNS-transzfert különféle sejttípusokba, például CHO-ba, csirke embrió fibroblasztokba, NINH-3T3-ba és Myeloid sejtekbe.
protokoll: Retrovirális fertőzés
rekombináns retrovirális állományokat úgy állítunk elő, hogy 5 ml növekedési táptalajt adunk 5% szérummal a transzfektált retrovirális csomagoló sejtek közel összefolyó egyrétegéhez egy 100 mm-es lemezen. 24 óra elteltével a táptalajt eltávolítjuk, és 0,45 um szűrőn szűrjük át.
a rekombináns retrovírus állománysal fertőzött sejteket 500 000 sejt / 100 mm-es lemez 10 ml teljes közegben.
24 órával később távolítsa el a táptalajt a sejtekből. Fertőzze meg a sejteket 2 ml vírus felülúszóval (vagy a vírusállomány hígításával 2 ml-re) 5-10 ug polibrén / ml jelenlétében (végső koncentráció). Inkubáljuk a sejteket 3-6 órán át 37cc-n.
adjunk hozzá 8 ml teljes táptalajt. Három nappal a fertőzés után ossza fel a sejteket 1: 5 arányban szelekciós közegbe.

Toyoshima, K. és Vogt, P. K., 1969. Virológia. 38: 414-426
Coelen, J. R., Jose, D. G. és May, J. T. 1983. Arch. Virol. 75: 307-311 protokoll: transzfekció lemezsejtek körülbelül 50% – os összefolyásnál a teljes növekedési közegben.
18-24 órával a bevonás után készítse elő a DNS-közepes-Polibrén oldatot, közvetlenül az alábbiak szerint:
Megjegyzés: minden komponenst a megfelelő sorrendben kell hozzáadni.
1.: teljes növekedési közeg (2mls egy 60 mm-es lemez és 3mls a
egy 100 mm-es lemez) melegítjük 37 Anavar C.
2.: plazmid DNS, 10ng 10ug. Óvatosan keverjük össze.
3.: Polibrén a végső koncentráció 5-10 ug / ml. Óvatosan keverjük
távolítsa el a táptalajt a lemezről, és adjunk hozzá DNS-közepes-Polibrén oldatot a sejtekhez. Inkubáljuk a sejteket a 37 C 6-20 órán át alkalmanként gyengéd ringató körülbelül minden 1.5 óra az első 6 órában.
távolítsa el a DNS-közepes-Polibrén oldatot, és óvatosan fedje le a sejteket DMSO sokk oldattal (15% DMSO 1x HBSS-ben: Specialty Media catalog #S-051-D) 3 ml / 60 mm-es edény és 4 ml / 100 mm-es lemez. Kézzel rock az edényt 10 másodpercig, hogy egyenletesen oszlatja el az oldatot, majd inkubáljuk a sejteket pontosan 4 percig 37 6.oc.
azonnal távolítsa el a DMSO sokk oldatot, és óvatosan öblítse le a sejteket kétszer teljes táptalaj, 5 ml / Mosás / 60 mm-es edény, 10 ml / mosás / 100 mm-es edény
Add hozzá a teljes táptalajt a sejtekhez.
stabil transzformánsok esetén távolítsa el a növekedési táptalajt, és ossza fel a sejteket 1:5 arányban szelekciós táptalajra.
átmeneti expresszió esetén távolítsa el a táptalajt, és adjon hozzá friss táptalajt. Betakarítás sejtek és / vagy közepes után 24-72 óra. Chaney, W. G. et al., 1986. Szomatikus sejtek és molekuláris genetika. Vol. 12, 23. szám,
237-244.
Aubin, R. J. et al. 1988. Szomatikus sejtek és molekuláris genetika. Vol. 14, 2. szám, 155-167.
Chisholm, O. et al., 1998. Nukleinsavak Kutatása. Vol. 16, No.5, 2352
reagens szállítjuk szűrjük át 0,2 um membránok és hidratált steril H20.