指数濃縮
アプタマーによるリガンドの体系的な進化は、バイオセンシングから治療に至るまでの幅広いアプリケーションのために生物受容体の分野で新規なカテゴリとして浮上している。 SELEXと呼ばれるスクリーニングプロセスのいくつかのバリエーションが報告されており、最終的な使用に必要な所望の特性を有する配列を得ることが
一本鎖オリゴヌクレオチドlibraryEditを生成する
SELEXの最初のステップは、それらのランダム化された領域のPCR増幅を可能にする定義された領域に隣接するいくつかの長さの完全または部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチド配列の合成を含み、RNA SELEXの場合には、ランダム化された配列のin vitro転写を含む。 EllingtonとSzostakは、化学合成がin vitro selectionに関する1990年の論文でオリゴヌクレオチドライブラリーのための-1015のユニークな配列を生成することができることを実証したが、これらの合成されたオリゴヌクレオチドの増幅は、PCRバイアスと合成された断片の欠陥に起因するプール多様性の有意な損失につながったことを発見した。 オリゴヌクレオチドプールが増幅され、確率的事象による潜在的な結合配列の損失を最小限に抑えるために、各個々の配列の多数のコピーが存在するように、最初のライブラリの十分な量が反応に追加される。 ライブラリーがインキュベーションと選択的保持のために標的に導入される前に、配列ライブラリーは、標的結合特性を有する構造的立体配座を達成するために一本鎖オリゴヌクレオチドに変換されなければならない。
ターゲットインキュベーション編集
ターゲット導入の直前に、一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリは、多くの場合、熱力学的に安定な二次および三次構造にオリゴヌクレオチドをrenatureするためにゆっくりと加熱され、冷却される。 調製されると、無作為化ライブラリーは、固定化された標的とインキュベートされ、オリゴヌクレオチド標的結合を可能にする。 ターゲット固定化方法とその後の未結合オリゴヌクレオチド分離のための戦略、インキュベーション時間と温度、インキュベーション緩衝条件、およびオリゴヌクレオチド濃度対ターゲットを含む、このターゲットインキュベーションステップのためのいくつかの考慮事項があります。 標的固定化法の例としては、アフィニティークロマトグラフィーカラム、ニトロセルロース結合アッセイフィルター、常磁性ビーズが挙げられる。 最近、SELEX反応は、ターゲットが完全な合流付近で拡張され、培養プレート上のオリゴヌクレオチドライブラリーとインキュベートされた全細胞である場合に開 インキュベーションバッファー条件は、意図されたターゲットと選択されたアプタマーの所望の機能に基づいて変更されます。 例えば、負に帯電した小分子およびタンパク質の場合には、ヌクレオチドが標的に接近し、特異的結合事象の可能性を高めることを可能にするために、電荷スクリーニングのために高塩緩衝液が使用される。 あるいは、所望のアプタマー機能が、潜在的な治療または診断適用のためのin vivoタンパク質または全細胞結合である場合、in vivo血漿塩濃度および恒常性温 インキュベーションバッファ条件のもう一つの考慮事項は、非特異的な競合他社です。 これらの非特異的結合部位を占有するために、これらの非特異的結合部位を占有するために使用することができる。 標的およびオリゴヌクレオチドの相対濃度を変化させることは、選択されたアプタマーの特性にも影響を与える可能性がある。 選択されたアプタマーに対する良好な結合親和性が懸念されない場合、過剰の標的を使用して、少なくともいくつかの配列がインキュベーション中に結合し、保持される確率を増加させることができる。 しかしながら、これは、利用可能な特異的結合部位に対する一意の配列間の競合が存在するように、オリゴヌクレオチドライブラリーが過剰であることを必要とする、高い結合親和性のための選択的圧力を提供しない。
Binding sequence elution and amplificationEdit
オリゴヌクレオチドライブラリーが十分な時間のためにターゲットとインキュベートされた後、未結合のオリゴヌクレオチドは、特定的に結合したオリゴヌクレオチドが保持されるように、多くの場合、インキュベーションバッファーを使用して、固定化されたターゲットから洗い流される。 未結合配列を洗い流すと、特異的に結合した配列は、尿素およびEDTAを含む変性溶液を使用して、脱イオン水中を流れることを含む結合立体配座のオリゴヌクレオチドの展開または喪失を促進する変性条件を作成することによって、または高い熱および物理的力を適用することによって溶出される。 結合配列の溶出時に、保持されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたは修飾塩基選択の場合にはＤＮＡに逆転写されるか、またはＤＮＡ ＳＥＬＥＸの場合には増幅のために単 溶出された配列からのこれらのＤＮＡ鋳型は、次いで、ＰＣＲを介して増幅され、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾塩基オリゴヌクレオチドに変換され、これらは、次の選択ＳＳＤＮＡＥＤＩＴの取得ＳＥＬＥＸ手順における最も重要なステップの１つは、ＰＣＲ増幅ステップの後に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を得ることである。 これは次の周期のための入力として役立ちます従ってすべてのDNAが一本鎖であり、できるだけ少しが失われることは重大な重要性をもちます。 相対的な単純さのために、最も使用される方法の一つは、増幅工程でビオチン化逆プライマーを使用しており、その後、相補鎖を樹脂に結合させ、その後、他の鎖を灰汁で溶出させることができる。 別の方法は、非対称ＰＣＲであり、増幅ステップは、過剰の前方プライマーおよび非常に少ない逆プライマーで実施され、これは、より多くの所望の鎖の産生を この方法の欠点は、生成物が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）およびＰＣＲ反応からの他の残された材料から精製されるべきであることである。 不要な鎖の酵素的分解は、リン酸プローブされたプライマーを用いてこの鎖をタグ付けすることによって行うことができる。 その後、これらの酵素はリン酸タグ鎖を選択的に分解し、相補鎖は無傷で残る。 これらの方法は全て、ＤＮＡの約５ ０〜７ ０％を回収する。 詳細な比較については、Svobodová et alの記事を参照してください。 ここで、これらの方法および他の方法は実験的に比較される。 古典的なSELEXでは、ランダム化された一本鎖ライブラリ生成、ターゲットインキュベーション、および結合配列溶出と増幅のプロセスは、保持されたプールの大部分がターゲット結合配列で構成されるまで繰り返されますが、多くの場合、以下で説明されている手順への変更と追加があります。
Negative or counter selectionEdit
所与のSELEX手順によって選択されたアプタマーの特異性を高めるために、負の選択、またはcounter selection、ステップは、標的インキュベーションの前または直後に追加することができる。 プールからターゲット固定化のマトリックスの部品のための類縁の順序を除去するためには、ライブラリーがターゲット固定化のマトリックスの部品と 負の選択の排除にも使えます配列に結合対象のような分子や細胞望のオリゴヌクレオチドの図書館の小さい分子標的類縁体は,望ましくない種類の細胞は、非対象タンパク質の固定に捕らdnaの塩基配列を決定した。
Tracking selection progressionEdit
SELEX反応の進行状況を追跡するために、溶出したオリゴヌクレオチドの数に相当する標的結合分子の数を、各ラウンドで溶出したオリゴヌクレオチドの推定された総入力と比較することができる。 溶出したオリゴヌクレオチドの数は、260nm波長吸光度またはオリゴヌクレオチドの蛍光標識による溶出濃度推定によって推定することができる。 SELEX反応が完了に近づくにつれて、標的に結合するオリゴヌクレオチドライブラリーの割合は100％に近づき、溶出分子の数は総オリゴヌクレオチド入力推定値に近づくが、より低い数に収束する可能性がある。
注意事項と考察編集
いくつかのSELEX反応は、二次構造形成のためのプライマー結合領域に依存しているプローブを生成することができます。 短い配列、したがってプライマーの切断が望ましいアプタマー用途がある。 独自の方法の進歩により、RNAライブラリーは、ランダム領域のみで形成されたときに不安定な二次構造を安定化させるため、選択プロセス後に除去する