研究対象、臨床標本、およびHLAジェノタイピング。 輸血の歴史を持つすべての被験者は、研究から除外された。 単信強皮症の歴史を持つ三十から二の家族が募集され、HLAクラスIIおよびクラスI対立遺伝子のために研究された;3世代は20家族と2世代12家族のた 子供を持つすべての女性のための研究エントリに三世代が必要であり、マイクロキメリズムは、これらの被験者の母親または子供から派生する可能性があるため、すべての子供の参加が必要であった。 男性、子供、および妊娠していない女性の参加には、2世代（すなわち、被験者と母親）が含まれていました。 一人の強皮症患者は双子であり、影響を受けていない双子も研究に募集された。 三十から三の健康なコントロール家族は、22と3世代と11と2世代を含む、募集されました。 HLAのgenotypingは254人の合計のために完了しました: 強皮症家族の128および対照の126。 いくつかの追加の家族のメンバーは、HLAハプロタイプの割り当てを確認するために含まれていました。 このデータベースから、被験体の母親がＨＬＡ特異的アッセイによって標的とされた非共有ＨＬＡ対立遺伝子を有していた場合、被験体はさらなる研究のために選 すべての被験者は、Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Boardによって承認されたインフォームドコンセントを付与しました。０ ７ ７ｇ／ｍｌでのｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａ Ｂ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）勾配遠心分離により、全ヘパリン化血液からＰｂｍｃを単離した。 一部の小児については、前述のように、ＨＬＡタイピングのために毛根からＤＮＡを抽出した（９）。 ゲノムＤＮＡを、Ｉｓｏｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｒｃａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ． Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を、製造者の説明書に従って、１ ０ｍ ＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ９． ＤＮＡの量および純度は、標準的な分光光度法によって決定した。 いくつかの被験者では、全血試料から直接ＤＮＡを抽出した。

配列特異的オリゴヌクレオチドプローブパネルを用いたDNAベースのタイピングは、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、およびDQB1遺伝子座で特定の対立遺伝子を同定 ＤＲＢ１の場合、最初の低分解能アッセイは、ＤＲＢ１ファミリー ＤＢＲ１＊０ １〜ＤＲＢ１＊１ ４を検出し、その後に、前述のように特定のＤＲＢ１対立遺伝子を同定する１つ以上の高解 ＤＱＡ１およびＤＱＢ１対立遺伝子を、新たに同定された対立遺伝子を検出するために追加のプローブを加えて、以前に記載された方法（９）と同様の方法を用いて ＨＬＡクラスｉ抗原は、２ ０個のＨＬＡ−Ａ、３ ０個のＨＬＡ−Ｂ、および８個のＨＬＡ−Ｃｗ抗原を識別する標準的なリンパ球毒性アッセイを用いて決定した。 いくつかの試料を配列決定に供して、特異的なＨＬＡクラスｉ対立遺伝子を決定した（１ ３）。 HLA対立遺伝子と抗原の割り当てとホモ接合性を確認するために、複数の家族のメンバーは、利用可能な場合、被験者の父親と兄弟を含む遺伝子型でした。HLA特異的PCRプライマー。

プライマー配列は、すべての既知の対立遺伝子配列（12）に基づいて設計された。 プライマー合成はオリゴ等で行った。 （米国オレゴン州ウィルソンビル）。 一つのプライマーセットは、HLAクラスI多型と3つの標的HLAクラスII多型を標的とするように設計されました。 HLA-B44を標的とするために、エクソン3の66位、69位、および75位の多型に基づいてHLA-B対立遺伝子の群と、エクソン3の229位の多型に基づいてHLA-B対立遺伝子の別の群を増幅するプライマーを設計した。 プライマーの組み合わせは、ＨＬＡ−Ｂ４ ４対立遺伝子を特異的に増幅し、１ ９ ０−ｂｐ断片を産生する。 すべてのDRB特異的プライマーは、エクソン2の超可変領域における配列多型に基づいて対立遺伝子群を増幅するように設計された。 HLA-DRB5*01の場合、一方のプライマーは、位置25、26、31、32、および38の多型に基づいてDRB5*01対立遺伝子の群を増幅し、他方は、位置215と231の間の多型に基づいてDRB5*01 プライマーの組み合わせは、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０ １対立遺伝子を特異的に増幅し、２ １ ０−ｂｐ断片を産生する。 HLA-DRB1*04の場合、一方のプライマーは、位置25、26、31、および36の多型に基づいてDRB1*04対立遺伝子の群を増幅し、他方は、位置97および110の多型に基づいてDRB1*04 プライマーの組合せはとりわけ104bpの片を作り出すDRB1*04を増幅します。 DRB1*04対立遺伝子間のさらなる差別は、位置258（コドン86）で二形性を区別する1の2プライマーと一緒に元のプライマーを使用することによって達成され、263bp HLA-DRB1*11の場合、一つのプライマーは、位置での多型に基づいてDRB1*11対立遺伝子のグループを増幅します25, 26, 28, 30, 31, 32, そして、第二のプライマーは、エクソン2の位置173および174における多型に基づいてDRB1*11対立遺伝子のグループを増幅する。 The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. ５Ｕ Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ ＰＣＲ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、２．ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、および各ＨＬＡ特異的プライマーの２ ０ｐｍｏｌを含む。 最終体積の５ ０μ Ｌを構成するために超純水を添加した。 増幅は、96℃で5分間、95℃で35秒間の35サイクル、および65℃で35秒間のHLA-B44（DRB5*01の場合は58.5℃、DRB1*04の場合は72℃、DRB1*11の場合は64.5℃）、次いで72℃で1分間、72℃で10分間の最終伸長ステップで構成されていた。 最適な増幅、感度、および特異性は、Mgcl2、およびプライマー濃度、thermocyclesの数、およびアニーリング温度を滴定することによって達成された。 全ての増幅は、Ｇｅｎｅａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９ ６ ０ ０ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。 アッセイ感度は、標的ＤＮＡを連続的に希釈し、被験体の対立遺伝子に対応する一定量の背景ＤＮＡに添加するスパイク実験によって決定した。 HLA-B44-およびDRB5*01-特異的PCRアッセイは、バックグラウンド500,000細胞内の少なくとも1つの標的細胞を検出することができた;HLA–DRB1*04-およびDRB1*11-特異的PCRアッセイは、100,000細胞のバックグラウンド内の少なくとも1つの標的細胞を検出することができた。 各ＰＣＲアッセイは、以下の対照を含んでいた：（ａ）目的のＨＬＡ対立遺伝子を有する細胞株由来のＤＮＡの陽性対照（０．; (b)被験体の母親からの陽性対照(0.2〜0.5μ g);(c)被験体と同じHLA対立遺伝子を有する細胞株からのDNAの陰性対照(1.25μ gおよび0.35μ g);および(d)DNAを有 ＰＣＲ産物を、Ｎｏｖｅｘ Ｘｃｅｌｌ Ｉ Ｉ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、６％または８％プレキャストＴＢＥゲル中で１ ０ ０Ｖ定電圧で１時間電気泳動した。 各ゲルは、陽性および陰性のＰＣＲ対照および１ ０ ０−ｂｐラダー（ＳＬＬ−１ ０ ０；Ｇｅｎｓｕｒａ，Ｄｅｌ Ｍａｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を含んでいた。 ゲルは、銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を乾燥し、Ｄｒｙｅａｓｅ Ｇｅｌ Ｄｒｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖｅｘ）で乾燥した。 全血から抽出されたDNAは、PBMCsを単離するのに不十分な量の4つのサンプルで試験した。 すべてのテストは重複して行われ、ほとんどのサンプルは複数回試金されました。

PCR予防措置。 PCR汚染の可能性を回避し、検出するために細心の注意を払った。 ＰＢＭＣ分離、ゲノムＤＮＡの抽出、ＰＣＲセットアップおよび増幅、およびＰＣＲ産物の分析のために別々の領域を使用し、ＰＣＲ前後のＰＣＲ試験を別々の実験室で実施した。 エアロゾル耐性ピペットチップ（Molecular Bio-Products Inc. Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を全ての実験で使用し、複数の陰性対照を全てのＰＣＲ増幅に含めた。HLA特異的PCR産物の配列決定。

最初のHLA特異的PCR産物の七マイクロリットルは、元のthermocyclingパラメータを使用して増幅の追加の40サイクルに供されました。 ７ ５％ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ａｇａｒｏｓｅゲル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）中で電気泳動し、臭化エチジウム（０． バンドを切除し、溶出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。、バレンシア、カリフォルニア州、米国）。 ０μ ｌのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｒｅ−ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈ Ｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を含む反応混合物１ ２に１ ０ ０ｎｇを加えた。５ｐｍｏｌの５’または３’プライマー、および１μ ＬのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ Ｏ．、セントルイス、ミズーリ、米国）。 超純水を加えて、最終容積２ ０μ Ｌを作製した。 配列決定反応混合物を、Ｇｅｎｅａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９ ６ ０ ０ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で９ ６℃で３分間加熱し、続いて、９ ６℃で１ ０秒間、５ ０℃で５秒間、および６ ０℃で４分間、２ ５サイクル加熱した。 得られたＰＣＲ産物をカラム精製し、上記のように電気泳動した。 センス配列およびアンチセンス配列は、被験者および母親のHLA特異的PCR産物、ならびに陽性対照細胞株PCR産物について、重複して決定した。 配列分析は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）からのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ９．

Cytospinスライドの調製およびin situハイブリダイゼーション。 Cytospinスライド製剤は、セックスミスマッチ幹細胞移植ペア（14）におけるキメリズムの定量分析のためのフレッド*ハッチンソン癌研究センター分子細胞遺伝学ラボラトリーで開発された技術を使用して、XおよびY染色体特異的配列の存在を分析した。 雄細胞のCytospinサンプルは、30,000–60,000新鮮に分離されたPBMCsをガラススライド、スライドあたり300μ l上に遠心分離することによって調製した。 スライドは、使用するまで乾燥室に保存した。 X染色体特異的プローブDXZ1(15)ジゴキシゲニンでニック翻訳され、Y染色体特異的プローブdyz1(16)ビオチンでニック翻訳されました。 XYプローブ混合物は、0.5μ g/mLの50％ホルムアミド、2×SSC（0.3M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム）、および10％デキストラン硫酸のハイブリダイ これを７ ２℃で５分間変性させ、氷上で冷却し、スライドに塗布した。 スライドをペプシンで消化した（0.1mg/mLで0.1mg/mL）。０ １Ｍ Ｈｃｌ）を３ ７℃で３分間固定し、４％緩衝ホルマリン中で１ ５分間固定し、ＰＢＳ中ですすぎ、エタノール（７ ０％、９ ５％、および１ ０ ０％）中で脱水し、空気乾燥させた。 スライドを２×ＳＳＣ（７ ２℃）で１ ０分間処理し、７ ０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ（７ ２℃）で３分間処理し、エタノール系列（−２ ０℃）で脱水し、空気乾燥させた。 プローブの十マイクロリットルは、スライドに適用され、ゴムセメントで密封されたカバースリップ（22×22mm）の下に取り付けられました。 これを加湿室内で４ ２℃で一晩インキュベートした。 スライドを、５ ５％ホルムアミド、２×ＳＳＣ（４ ５℃）で１ ５分間、および２×ＳＳＣ（室温）で５分間洗浄した。 プローブシグナルを、フルオレセイン結合抗−ジゴキシゲニン（１：５ ０ ０希釈；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎ，ＵＳＡ）およびＴｅｘａｓ ｒｅｄ−ｃｏｕｐｌｅｄ ａｖｉｄｉｎ（１：５ ０ ０希釈；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、暗所で室温で３ ０分間、同時に検出した。 ２×ＳＳＣおよびＰＢＳで洗浄した後、それらをＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に装着した。 スライドは、適切なシングル、ダブル、およびトリプルバンドパスフィルタを装備した100-W水銀ランプとニコンE600epifluorescence顕微鏡を使用して直接評価した。 2つの目に見える染色体シグナルを持つ細胞のみが、電子増強を使用せずに列挙された。