細胞外マトリックス調製とレオロジー

ECMはゼラチンとフィブリンのネットワークで構成されています。 ＥＣＭ成分を調製するために、ｄｐｂｓ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない１Ｘ Ｄｕｌｂｅｌｃｏのリン酸緩衝生理食塩水）の温かい溶液（７ ０℃）にゼラチン粉末を添加するこ ゼラチンを70℃で12時間撹拌することによって完全に溶解させ、次いで1M NaOHを用いてpHを7.5に調整する。 この溶液を滅菌濾過し、後の鋳造での使用のためにアリコート中に４℃で保存する（＜ｄｉｖ ｉｄ＝”０ ３ ０ ２ ４ ０ａ６ ３ ３”＞＜／ｄｉｖ＞３ヶ月）。 フィブリノゲン溶液（50mg/mL）は、カルシウムおよびマグネシウムを含まない滅菌DPBSに37℃で凍結乾燥ウシ血漿タンパク質（ミリポア）を溶解することによ 溶液は、完全な溶解を可能にするために、少なくとも45分間撹拌せずに37℃に保持される。 Transglutaminase(tg)の解決(60mg/mL)はカルシウムおよびマグネシウムなしでDPBSで凍結乾燥させた粉(Moo Gloo)を分解し、穏やかに20秒の間混合することによって準備されます。 Cacl2ストック溶液（250mM）は、カルシウムおよびマグネシウム（コーニング）なしでDPBSにCacl2粉末を溶解することによって調製される。 トロンビンの原液を調製するために、凍結乾燥トロンビン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を滅菌ＤＰＢＳを用いて５ ０ ０Ｕ／ｍＬで再構成し、−２ ０℃で保存する。

インクレオロジー測定には、直径40mm、2°コーンおよびプレート形状を有する制御されたストレスレオメーター（DHR-3、TA Instruments、New Castle、DE）が使用されます。 せん断貯蔵（Ｇ’）および損失（Ｇ”）係数は、１Ｈ Ｚの周波数および０． タイムスイープは、37℃で保持されたペルチェプレート上にトロンビンを含む予混合ECM溶液を迅速に配置することによって行われます。

インク製剤

灌流可能なPTモデルの3Dバイオプリンティングには二つのインクが必要です。 灌流チップガスケットを作製するために使用される１つのインクは、遠心ミキサーを使用して２分間均質化された１ ０：１塩基対触媒（重量基準）を有する２部 シリコーンインクは触媒との混合の2hの内で印刷されます。 このインクは注射器（EFD Inc.,East Providence,RI)を遠心分離し、室温で印刷する前に任意の気泡を除去した。 他のインク、尿細管を印刷するために使用される逃亡インクは、脱イオン、限外濾過（ＤＩＵＦ）水中の３ ８重量％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１ ２ ７（Ｓｉｇｍａ）および１ ０ ０Ｕ／ｍｌトロンビンから構成される。 Ｆｕｇｉｔｉｖｅ ｉｎｋは、図１の可視化のためのＲｉｓｋ Ｒｅａｃｔｏｒ染料を添加することによってピンク色に染色される。 1と映画S1. 使用前に、２ ０ ０ ０Ｕ／ｍＬトロンビン溶液をｆｕｇｉｔｉｖｅ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）インクに１：２ ０の比率で添加し、Ｔｈｉｎｋｙ ｍｉｘｅｒを使用して均質化する。 次に、ｆｕｇｉｔｉｖｅ ｉｎｋを注射器に装填する（ＥＦＤ Ｉｎｃ．,East Providence,RI)を4°Cで遠心分離し、気泡を除去した。 印刷する前に、このインクは室温で少なくとも15分間平衡化される。

灌流可能な3d近位尿細管構造物のバイオプリンティング

3D PT構造物は、725mm×650mm×125mmのビルド容積を有する3軸、動き制御ガントリーに取り付けられた四つの独立してアドレス指定可能なプリントヘッドを備えたカスタム設計のマルチマテリアル3D bioprinterを用いて製造されている（AGB10000、Aerotech Inc.、ピッツバーグ、PA米国）。 インクは、異なるサイズ（すなわち、直径５ ０μ ｍ〜４ １ ０μ ｍ）のノズルが、ｌｕｅｒ−ｌｏｃｋ（ＥＦＤ Ｉｎｃ．、イーストプロビデンス、RI、米国）。 インクは、空気圧を印加することによって蒸着ノズルを通して押出される（８ ０ ０Ｕｌｔｒａ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ＥＦＤ Ｉｎｃ．,East Providence,RI,USA),10-90psiの範囲,1mm/sと5cm/sの間の印刷速度に対応します.我々は最初にテーパ410μ mのノズルを介してシリコーンインクを堆積させることによ ガスケット設計は、最終的なガスケット構造のGコードを生成するカスタムMATLABスクリプトを使用して作成されます。 印刷後、灌流チップガスケットをオーブンで80℃で>1時間硬化させ、使用前に室温で保存する。

灌流チップ内で3D PTsをパターニングするには、ECMのキャストと逃亡インクの印刷の組み合わせが必要です。 最初に、10mg/mLのフィブリノーゲン、7.5重量％のゼラチン、2.5mMのCacl2および0.2重量％のTGを組み合わせることによってECM溶液を作成する。 次いで、この溶液を、ＥＣＭ２ ５の光学的透明性を改善するために使用する前に、３ ７℃で１ ５〜２ ０分間平衡化する。 次に、溶液をトロンビンと５ ０ ０：１の比で急速に混合し、最終トロンビン濃度を１Ｕ／ｍＬにする。 37°Cの2分以内に、フィブリノゲンのフィブリンゲルへの重合が続く。 このため、ecm溶液は、トロンビンと混合した直後に灌流チップのベース上にキャストする必要があります。 次いで、ベースＥＣＭ層を、平坦な表面を形成するように、窒素下でわずかに乾燥させる。 Fugitive Pluronic F127インク（100U/mLトロンビンと）は先を細くされた200µ mのノズルを使用して複雑なfilmament（tubule）の形で基礎ECMの層で印刷される。 カスタムPythonスクリプト(MeCode)は、Gコードでツールパスを指定するために使用されます。 直接逃亡インク印刷の後で、シリコーンのガスケットを通してインターフェイスされる金属の空の散水ピンは印刷されたインクが付いている接触 次いで、ｅｃｍの最上層は、上記のように、印刷された尿細管上にｅｃｍ溶液をガスケット壁の高さの１〜２ｍｍ以内にキャストすることによって形成される。 Ｈｎｄｆのような細胞がＥＣＭに組み込まれる場合（図４）。 S5)、それらは、平衡期間の直後、トロンビン混合およびその後の鋳造の前に混合される。 上部ECM層をキャストした後、構築物をガラススライドで覆い、蒸発または汚染を防止し、37℃で1時間保持してフィブリン重合を終了させ、TGをネットワーク その後、構築物を4℃に15-20分間冷却して印刷された逃亡インクを液化させ、冷たい細胞媒体を使用して装置から洗い流され、管外ECM空間内の細胞の有無にかかわらずECM内に埋め込まれた所望の管状ネットワークとして機能する開いた導管を残す。

この方法を使用して、我々はまた、層ごとのビルドシーケンスで3Dアーキテクチャを生成しました。 例えば、図に示す三層構造の各個々の層。 S10は前に論議される材料および方法を組み込む変更された印刷の議定書を使用して組み立てられた。 最初の尿細管を逃亡インクで印刷した後、ECMの層を印刷上にキャストし、次の近位尿細管層が最近ゲル化された層の上に逃亡インクで印刷される前に、20分で37℃でゲル化させることができる。 この連続的な構造は3D幾何学をもたらし、構造の後ですべてのチャネルの巧妙な避難を独自に可能にする。 水性ベースのリスクリアクター染料は、チャネルを介して灌流され、可視化のためにUV光で励起される。

3Dティッシュの破片の組立工程を完了するためには、各PTの構造物は機械で造られたステンレス鋼の基盤に置かれ、厚いアクリルのふたは上に ふたおよび基盤は印刷されたシリコーンのガスケットのまわりでシールを形作る4本のねじによって一緒に締め金で止められます。 次に、滅菌された2停止蠕動チューブ（PharMed BPT、内径0.25mm）を媒体で満たし、10mlシリンジバレル（EFD Nordson）に取り付けられた滅菌フィルターの出口に接続します。 >3hのために平衡化されているPTEC培地（成長のために設計されているので、ATCC製剤と1％FBS、1％アプロチニン、および1％アンチアンチ）は、37℃のインキュベー その後、シリンジを使用して、バレル内の媒体にわずかな圧力をかけ、取り付けられたチューブに入り、完全に充填するように強制します。 回路に接続する前にチューブを媒体で充填すると、システムへの気泡の導入が防止されます。 灌流回路を完了するためには、貯蔵所からのシリコーンの管は破片の入口の金属の灌流ピンに接続される。 ホースのピンチオフクランプは散水の破片の入口そして出口で上皮を傷つけるか、または気泡がシステムに入るようにすることができる蠕動性ポ 媒体の貯蔵所は媒体の貯蔵所の上の生殖不能フィルターによって定温器の大気条件といつも平衡する。ヒト不死化Ｐｔｅｃ（ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−４ ０ ３ １）をＡＴＣＣの説明書に従って培養し、継代２ ０までの全てのＰＴモデル研究に使用する。

細胞培養

ヒト不死化Ｐｔｅｃ（ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−４ ０ ３ １） 遺伝子発現解析のために、ヒト一次ＲＰＴＥＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、不死化Ｐｔｅｃ（ＲＰＴＥＣ−ＴＥＲＴ１、Ｅｖｅｒｃｙｔｅ）およびＡ４ ９ ８（ＡＴＣＣ Ｈ Ｔ Ｂ−４ ４）腎癌細胞を使用し、供給者の指示に従って培養する。 ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＮＤＦ）、ＧＦＰ発現（Ａｎｇｉｏ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ）は、供給業者の指示に従って培養され、第１ ５節まで使用される。ヒト一次ＲＰＴＥＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、不死化ＲＰＴＥＣ−ＴＥＲＴ１（Ｅｖｅｒｃｙｔｅ）およびＡ４ ９ ８（ＡＴＣＣ Ｈ Ｔ Ｂ−４ ４）腎癌細胞を、供給業者の指示に従って９ ６ウェルプレート中で増殖させ、培養培地を１ ０ ０μ ｌ／ウェルの１Ｘ ＲＮＡ溶解混合物（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｋｉｔ、ＱＳ０ １ ０ １） 次いで、４ ０μ ｌのライセートをｍＲＮＡ捕捉磁気ビーズセット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ｓｅｔ１ ２ ６ ３ １、カタログ番号３ １ ２ ６ ３ １）と混合し、一晩インキュベートし、分枝ＤＮＡ増幅のために処理し、製造業者の説明書（Ｐａｎｏｍｉｃｓ Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＱＰ１ ０ １ ５） PPIBプローブは、正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用されます。 蛍光強度（FI）データは、3つの生物学的複製の平均および標準偏差として提示されています。

培地潅流液のサイトカイン分析

培地潅流液は、細胞播種後25日間にわたって尿細管から収集され、分析前に-80℃で保存される。 サイトカインプロファイリングのために、上清を氷上で解凍し、試料希釈緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ ｃａｔａｌｏｇ＃Ｍ６ ０−０ ０ ９ＲＤＰＤ）中で２倍に希釈し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ（商標）ヒトケモカインＩＬ−６（セット＃１ ７ １ＢＫ２ ９ＭＲ２）、ＩＬ−８（biorad）製造業者の指示に従って。 データは、平均サイトカイン濃度および技術的な三重化合物の標準偏差として報告されています。

上皮化および縦培養

各3D PT構築物は、細胞負荷/播種の前にインキュベーター内のPTEC培地で数時間灌流される。

各3D PT構築物は、細胞負荷/播種の前にインキュベーター内のPTEC培地で数時間灌流される。

ＰＴＥＣ（ＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１、ＡＴＣ Ｃ）を、それらの培養皿からトリプシン化し、培地中で〜２×１ ０ ７細胞／ｍＬに濃縮する。 次いで、細胞懸濁液は、出口を介して灌流チップに装填される（図１ ０Ａ）。 S3b,c)。 ロードされた構築物は、数時間インキュベーター内に横方向に配置され、尿細管壁の均一な播種を可能にするために、複数の半時間間隔にわたって180°反転し、 翌日、非付着性細胞は、重力による流れの下で尿細管から洗い流される。 次いで、新鮮な培地の灌流が開始され、残りの細胞が集塊し始め、次いでそれらのコロニーから成長する（図１ ０Ａ）。 S3f)播種後約3週間で合流に達するまで(Fig. S3k）。 成長期には、ＡＴＣＣガイドラインに従って調製したＰＴＥＣ培地に、１％アプロチニン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＥＣＭの分解を遅くするために使用）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％抗生物質−抗真菌（Ｇｉｂｃｏ）を 成熟後、FBSを除去し、PTECsはタイトな上皮単層にパックします（Movie S2）。 1日目の後播くことで、PTECsはtubuleの横断面によって0.1そして0.5dynes/cm2の間で変わるせん断圧力に一致する1µ l/minの連続的な、単方向流れに露出され 媒体は閉じたループ回路の蠕動性ポンプによって与えられ、2日毎に変わる。

アルブミン取り込み研究

アルブミン取り込みは、印刷された3D PTモデルだけでなく、2Dコントロールのために評価されます。 第一の対照は組織培養プラスチック上で成長したＰｔｅｃからなり，第二の対照はＥＣＭ上で成長したＰｔｅｃからなる。 それぞれの場合において、Ｐｔｅｃを合流まで成長させ、無血清培地中で成熟させる。 ＦＩＴＣと結合したヒト血清アルブミン（Ｈ Ｓ Ａ−ＦＩＴＣ、Ａｂｃａｍ ａ ｂ８ ０ ３ ０）を、ＰＴＥＣ培地中に５ ０μ ｇ／ｍＬで懸濁させる。 全てのサンプルをＨ ＳＡ−ＦＩＴＣと共にそれらの培地中で２時間インキュベートする（灌流の場合、それは開放内腔を通して灌流される）。 暴露後、全ての試料を３倍量で洗浄し、次に１ ０倍量のトリプシンでトリプシン化して個々の細胞を収集する。 細胞を固定し、メガリンに対する一次抗体および二次抗体で対比染色する（表Ｓ２は、使用される特異的抗体を列挙する）。 これらの試料からの細胞、および裸の細胞を、フローサイトメトリー（Ｂ Ｄ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）によって分析し、サンプル当たりｎ＝１ ０，０ ０ ０細胞からデータを収集する。 Ｐｔｅｃ中のＨ Ｓ Ａ−ＦＩＴＣおよびｍｅｇａｌｉｎの画像を得るために、洗浄ステップの後にトリシン化される代わりに、試料をホルマリンで所定の位置に固定する。 これらのサンプルは、メガリンのために対比染色され、共焦点顕微鏡（Zeiss LSM710）を用いて撮像される。

シクロスポリンAテスト

2Dコントロールとバイオプリントされた3D PTsの両方に対するCysAの効果が検討されています。 2Dでは、細胞は組織培養プラスチック上に96ウェル形式で播種され、confluencyに成長させます。 それらはATCCの指針に従って供給された媒体である。 ＣｙｓＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＭＬ１ ０ １ ８）を種々の濃度でそれらの培地中に懸濁し、細胞と２ ４時間インキュベートする。（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）をフェナジンメト硫酸塩（ＭＴＳ）の存在下で このアッセイは、それらがコンフルエンスに達した日に細胞にCysAを与えることによって、早期コンフルエンスでPTECs上で完了し、ならびにそれらがコンフルエンスに達した数日後にCysAを与えることによって、後期コンフルエンスで完了する。 特に、毒性の結果は、それぞれの場合について類似している（図１ ０Ａ）。 5n）。 3D PTsのために、CysAはconfluencyに達した後成長した細管の開いた内腔を通してさまざまな集中で与えられます（~3週の印で）、血清は最低10日間媒体に含まれてい Ｃｙｓａ曝露後２ ４時間で、Ｆｉｔｃ−デキストラン漏れ試験（後述）を実施して、Ｐｔｅｃのバリア機能に対する摂動を評価し、定量する。 直接に続いて、PTは10％緩衝ホルマリンを使用して1時間固定され、アクチンおよびDAPIについて対染色される（表S2は、使用される特定の染色を一覧表示する）。

拡散透過性測定

3Dにおける上皮のバリア機能を評価するために、拡散透過性は、25μ g/mLのFITC共役70kDaデキストラン（FITC-Dex、Sigma製品46945）を含む開放ルーメン内のPTEC培地を15μ l/分3分、その後1μ l/分30-45分の速度で灌流することによって定量化される。 全体の試験は、視野内の尿細管および周囲のＥＣＭの両方を用いた生細胞イメージング下で実施される（図１ ０Ａ）。 S9）。 ＦＩＴＣ−Ｄｅｘの拡散パターンは、広視野蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ４ ０ＣＦＬ）を用いて検出される。 蛍光画像は、灌流前および30〜45分の期間にわたって3〜5分ごとに捕捉される。 FITC-Dexの拡散透過性は、以下のequation34を使用して経時的な蛍光強度の変化を定量化することによって計算されます。

Pdは拡散透過性係数、I1は初期時点での平均強度、I2はt-30-45分での平均強度、Ibは背景強度（FITC-Dexの灌流前に撮影された画像）、dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数、Dは拡散透過性係数。はチャネルの直径です。 他の研究者はPTECsが測定された拡散の透磁率のためのわずかにより高い価値をもたらすdextran39をresorbできることを報告しました。

我々はまた、上記と同じ方法を用いてPTECsによってin vivoで再吸収も分泌もされない低分子量化合物、イヌリン（4.5kDa）を用いて、上皮内細管のバリア特性を調 具体的には、イヌリン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ製品Ｆ３ ２ ７ ２）を温めたＰＴＥＣ培地に１ ０ ０μ ｇ／ｍｌで溶解し、開放管腔内で３分間２ ０μ ｌ／分の速度で灌流し、その後約１ ５分間１． 全体の試験は、視野内の尿細管および周囲のＥＣＭの両方を用いた生細胞イメージング下で実施される（図１ ０Ａ）。 S7）。 ＦＩＴＣ-イヌリンの拡散パターンは広視野蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて検出した。 蛍光性のイメージは散水の前のゲートで飾られた光源および動きによって制御された段階とそして15分の期間にわたる3から5分毎に技術的な三重の測定を集めるために捕獲される。

電子顕微鏡

透過型電子顕微鏡（TEM）の場合、2Dまたは3Dアーキテクチャまたは移植前の標準生検から得られた健康なヒト腎臓組織のPtecは、2.5％グルタルアルデヒド、1.25％パラホルムアルデヒド、0.03％ピクリン酸を0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファー（pH7.4）中で最低数時間固定される。 小さな試料（１ｍｍ×１ｍｍ）を除去し、０.１Ｍカコジレート緩衝液中で洗浄し、１％オスミウムテトロキシド（Ｏｓｏ４）（ＥＭＳ）および１に浸漬した。5%potassiumferrocyanide(Kfecn6)(Sigma)1時間、水3xで洗浄し、1%酢酸ウラニル水溶液(EMS)で1時間インキュベートした後、水で2回洗浄し、その後様々なグレードのアルコール中で脱水した(各10分; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 分100％）。 次いで、試料をプロピレンオキシド（ＥＭＳ）中に１時間入れ、プロピレンオキシドおよびＴＡＡＢ Ｅｐｏｎの１：１混合物中で一晩インキュベートした（Ｍａｒｉｖａｃ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ． セントローラン、カナダ）。 翌日、試料をＴＡＡＢ Ｅｐｏｎに包埋し、６ ０℃で４ ８時間重合させた。 極薄切片（約60nm）をReichert Ultracut-Sミクロトーム上で切断し、クエン酸鉛で染色した銅グリッド上に置き、JEOL1200EX透過電子顕微鏡で検査し、AMT2k CCDカメラで画像を記録する。 画像解析は、ImageJソフトウェアを使用して実行されます。

走査型電子顕微鏡（SEM）のために、3Dで灌流Ptecは、10％緩衝ホルマリンを使用して1時間固定されています。 固定剤はPbsx2およびエタノールのさまざまな等級のそれに続く脱水を使用して洗浄されます（20分それぞれ; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 分100％）。 次いで、試料を５ ０％エタノールおよび５ ０％ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）中に３ ０分間入れ、続いて１ ０ ０％ＨＭＤＳを３×３ ０分間入れた。 すべてのステップは、密閉された密閉されたガラス容器内で実行されます。 ＨＭＤＳによる最終洗浄の後、試料を除去し、ヒュームフード内のＮ２の下の開いた容器に入れて乾燥させる。 乾燥させたサンプルは伝導性カーボンテープを使用してアルミニウムピン台紙に取付けられ、金が塗られるスパッタし、Tescan Vega SEMとイメージされる。

免疫染色

免疫染色に続いて共焦点顕微鏡を用いて、2Dおよび3D PTECモデルにおけるタンパク質の細胞局在を評価する。 免疫染色の前に、各構築物をＰＢＳで洗浄し、次いで、１ ０％緩衝ホルマリンを使用して２ ０分〜１時間固定する。 固定剤を、ＰＢＳ中の数回の洗浄を使用して数時間除去し、次いで、ＰＢＳ中の１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）を使用して一晩遮断する。 目的の細胞タンパク質またはバイオマーカーに対する一次抗体を、0.5重量％のBSAおよび0.125重量％のTriton X-100の溶液中で、表S2に記載されている希釈液で構築 非結合一次抗体の除去は、pbsまたは0.5重量％のBSAおよび0.125重量％のTriton X-100のPBS中の溶液に対する洗浄工程を用いて1日間達成される。 二次抗体を、PBS中の0.5重量％BSAおよび0.125重量％Triton X-100の溶液中で、表S2に記載されている希釈液で構築物と1日間インキュベートする。 試料を、ＮｕｃｂｌｕｅまたはＡｃｔｉｎｇｒｅｅｎで２時間逆染色し、次いで、撮像前にＰＢＳ中で１日間洗浄する。

画像レンダリングと分析

位相契約顕微鏡は、1.25Xから40Xの範囲の目的を持つ逆ライカDM ILスコープを使用して行われます。共焦点顕微鏡は、直立Zeiss LSM710を使用して行われ、5Xから40Xの範囲の水浸対物レンズは、405、488、514、561、および633nmの波長のスペクトルレーザーを使用して行われます。 Zスタックの画像再構成は、最大ピクセル強度の設定を持つz投影関数を使用してImageJで実行されます。 明るさの任意の増加は、z投影画像全体にわたって均一に実行されます。 3D画像再構成と回転ムービー(Movie S3)は、Imarisソフトウェアを使用して実行されます。 定温器システムの新しいCytoSMART（Lonza）がタイム経過イメージ投射（映画S2）を捕獲するのに使用されている。 拡散透過性の定量化のための画像解析は、以前に報告された方法34を用いたカスタムMATLABスクリプトを用いて行われる。 Ｔｅｍ画像解析は、Ｉｍａｇｅｊソフトウェアを使用して、各条件について少なくとも３つの独立したサンプルにわたって、細胞の高さ（ｎ≧５ ０）、微絨毛密度（ｎ≧２ ５）、および微絨毛長さ（ｎ≧１ ５ ０）を測定するために実施される。

統計分析

データは平均±標準偏差として表されます。 統計分析はMATLABを使用して実行され、統計的有意性は、Tukeyの多重対比較検定を使用したANOVAによって決定されるように、p<0.05の値で決定 異なる有意水準（p値）はアスタリスクで示され、特定のp値は各図の凡例に示されます。