筋上皮細胞の形態：安静時から運動期までの免疫組織化学的特性評価
要約
筋上皮は、安静時および増殖性基底上および紡錘および星状 正常および腫よう性乳腺における四つの異なる筋上皮細胞形態型の同定のためのマーカーのパネルを評価し，上皮から間葉系表現型への免疫組織化学的変化を調べた。 サイトケラチン19（CK19）、サイトケラチン5/6（CK5/6）、サイトケラチン14（CK14）、エストロゲン受容体（ER）、p63タンパク質、ビメンチン（VIM）、およびα-平滑筋アクチン（Α-SMA）抗体は、29新生物（3良性および3悪性筋上皮腫瘍、良性混合腫瘍における7癌および16複合癌）および乳腺の正常組織に使用された。 これらの抗体はすべて、乳腺病理を有さない動物からの3つの乳腺組織についても試験した。 筋上皮マーカーは基底上細胞でよく発現し，運動型では徐々に失われ，星状細胞は間葉系に典型的なＶＩＭ発現のみを維持した。 ERは、いくつかの休息および運動性筋上皮細胞を標識した。 我々の結果に基づいて、我々は移動性線維芽細胞様細胞への筋上皮immotile細胞からの移行を提案します。 この移行と安静時および運動性筋上皮細胞のための免疫組織化学的パネルの特性評価は、筋上皮細胞の生物学的挙動に多くの光を当てました。
1. はじめに
イヌの乳腺腫瘍は、上皮（上皮および筋上皮）および間葉系成分の両方によって形成される。 間葉系細胞の起源はまだ議論されている。 筋上皮または基底細胞増殖を示す腫瘍の頻度の上昇は、イヌ乳腺腫瘍のユニークな特徴である。
正常な乳腺では、管腔は、上皮細胞および筋上皮細胞の2つの外側または基底層上に置かれた偏光上皮細胞の内層によって区切られる。 基底細胞および筋上皮細胞の両方が管および肺胞の基底膜を合成し、管腔上皮細胞と周囲の間質との間に構造的障壁を形成する。 ダクトでは、筋上皮細胞は、ダクトの長軸に平行に配向した細胞のほぼ連続的な層を形成する。 この層は、管腔上皮細胞を取り囲み、それらを基底膜および間質から分離する。 肺胞では、筋上皮細胞は不連続であり、肺胞の周りにバスケット状のネットワークを形成し、いくつかの管腔上皮細胞が基底膜に直接接触することを可 したがって、筋上皮は、これら二つのコンパートメント間で通信するための理想的な位置に位置するだけでなく、正常な細胞構造の維持のための重要な
免疫組織化学に基づいて、正常な乳腺の細胞の三層は異なるマーカーを表示する: 管腔上皮は、ＣＫ１ ９によって標識され、基底細胞および筋上皮細胞は、ＣＫ５／６およびＣＫ１ ４およびｐ６ ３、Α−ＳＭＡおよびＶＩＭによって染色される。 筋上皮細胞は、上皮と平滑筋の複合免疫プロファイルを示す収縮性要素である。 上記のマーカーは、核マーカーであるp63を除いて、細胞質に発現される。 筋上皮細胞層は、関連する腫瘍細胞の増殖および浸潤において有意に阻害される腫瘍抑制剤p63の唯一の供給源である。 さらに，正常乳腺の基底筋上皮細胞はER抗体によって標識されることがあり，これはイヌ乳腺腫ようの分子ベースの分類に使用される。
異なる筋上皮細胞の形態は、犬の複合腫瘍および混合腫瘍で認識することができます：安静時および増殖性基底上筋上皮細胞および紡錘形および星状運動性間質筋上皮細胞。 基底膜上細胞は、基底膜と管腔上上皮との間に位置し、平坦化された紡錘形（休止細胞）または多角形の形態（増殖細胞）を示す。 間質細胞は、しばしば上皮要素に付随する固体巣に配置されるか、または間質に単離される。 紡錘および星状筋上皮細胞は、より一般的な収縮表現型に向かって分化する。
間質性筋上皮細胞は、最終的には線維芽細胞様細胞になり、VIM免疫反応性のみを示すことがある。 筋上皮分化は，イヌ乳腺混合腫ようにおける軟骨および骨を含む種々の間葉組織の形成において最高潮に達する可能性がある。
間葉細胞の典型的な特徴の獲得は、上皮間葉移行（EMT）を介して発生する可能性が高い。
間葉細胞の典型的な特徴の獲得は、上皮間葉移行（EMT）を介して発 EMTは、通常、その基底表面を介して基底膜と相互作用する偏光上皮細胞が、間葉細胞の形質と機能を引き受けることを可能にする複数の生化学的変化を
本稿では、犬の筋上皮細胞と乳腺腫瘍の様々な側面に焦点を当て、具体的には(1)抗体のパネルを用いた正常および腫瘍性乳腺における四つの異なる筋上皮細胞の形態学的タイプのキャラクタリゼーションと(2)上皮から間葉の表現型への筋上皮細胞の免疫組織化学的変化に焦点を当てます。
2. 材料および方法
2.1. サンプル
29匹の雌犬の乳腺標本は、ボローニャ獣医学部の解剖病理学サービスのデータベースから取得されました。 被験者に帰属の異なる品種:mongrel(𝑛=13),ドイツ語の羊飼い(𝑛=3),プードル(𝑛=3)では、ヨークシャー-テリア(𝑛=3)ダ𝑛=2),セッター(𝑛=1)ですが、ポインタ(𝑛=1)ですが、コッカ-スパニエル(𝑛=1)のャイアントシュナイザー(𝑛=1)、シベリアンハスキー(𝑛=1)ですべての女性 平均年齢9.20±2.28年(平均値±SD). 腫瘍は、3つの良性筋上皮腫瘍、3つの悪性筋上皮腫瘍、良性混合腫瘍における7つの癌腫、および16つの複合癌腫（最後の二つのグループは、混合腫瘍における軟骨および/または骨の存在によって区別された）から構成されていた。 さらに、同じ腫瘍ラインの正常な乳腺からの29の標本および3健康なnonmammary腫瘍軸受け女性犬からの3つの乳腺のサンプルは評価されました。
腫瘍は、Misdorp et al. およびＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ ｅ ｔ ａ ｌ． 良性筋上皮腫瘍に：細胞外線維性好塩基性物質と混合した短い束に配置された筋上皮細胞からなるまれな新生物;悪性筋上皮腫瘍：より多形性筋上皮細胞: 管腔の上皮性およびmyoepithelial部品で構成される癌腫;良性腫瘍の癌腫:繊維状ティッシュと組合せて軟骨および/または骨を多分作り出した間葉系細胞と一緒に発生するそのような細胞の悪性現われる上皮細胞または明瞭な小節の焦点が付いている腫瘍。
2.2. 免疫組織化学
四μ mの厚さのセクションは、代表的な腫瘍サンプルを含むホルマリン固定パラフィン埋め込まれたブロックからカットしました。 以下のマーカーのための免疫組織化学は、これらの組織に行われました: CK19、ER、CK5/6、CK14、VIM、アルファSMA、p63。
切片をトルエン中で脱ワックスし、再水和した。 内因性ペルオキシダーゼは、0.3％過酸化水素に20分間浸漬することによってブロックされた。 次に切片をＴｒｉｓ緩衝液中ですすいだ。 抗原検索は、クエン酸緩衝液（2.1gクエン酸一水和物/リットル蒸留水）、pH6.0（EDTA、pH8.0を使用したCK5/6およびERを除く）を用いて行われ、電子レンジで5分間加熱し、750Wで室温で20分間冷却した。 一次抗体を表１に要約する。 全ての一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、続いて市販のｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ技術（ＬＳＡＢ Ｋｉｔ，Ｄａｋｏ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を行った。 ジアミノベンジジン（室温で0.05％10分間）を色原体として使用した。 スライドはパパニコラオウのヘマトキシリンでカウンターステインされた。
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各マーカーによる陽性細胞の数を半定量的に計算した：-=染色された細胞なし、±=5％未満の陽性細胞、+=5-50％陽性細胞、++=50％以上の陽性細胞。 核染色が少なくとも5％の腫瘍細胞で観察された場合、症例はER陽性であると考えられた。
3. 結果
筋上皮細胞の四つのタイプは、その形態に基づいて認識されました。 静止サブタイプは、管腔上上皮細胞と密接に接触している紡錘細胞の細長い特徴を示し、代わりに多角形を示した基底上細胞を増殖させた（図1（a））。 間質運動細胞は、巣を形成すること（紡錘型の並んだ巣と星細胞が巣のコアを構成する）の両方を観察し、間質に単離された（図2（a））。
(a)
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(c)
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(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
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(g)
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(h)
(h)
(h)
(f)
基底上筋上皮細胞：安静時（薄い矢印）および増殖性（厚い矢印）細胞。 ＩＨＣ、６ ３ｘによって適用される抗体のパネルの免疫組織化学的発現；（ａ）ヘマトキシリン−エオシン；（ｂ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ９抗体；（ｃ）核を標識する抗ＥＲ抗体；（ｄ）細胞質を標識する抗ＣＫ５／６抗体；（ｅ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ４抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ９抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ９抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ９抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ９抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＣＫ１ ９抗体；; 抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＶＩＭ抗体；（ｇ）細胞質膜を標識する抗Α−ＳＭＡ抗体；（ｈ）核を標識する抗ｐ６ ３抗体；（ｈ）細胞質膜を標識する抗Ｐ６ ３抗体；（ｈ）細胞質膜を標識す
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; 抗体；（ｆ）細胞質を標識する抗ＶＩＭ抗体；（ｇ）細胞質膜を標識する抗Α−ＳＭＡ抗体；（ｈ）核を標識する抗ｐ６ ３抗体；（ｈ）細胞質膜を標識する抗Ｐ６ ３抗体；（ｈ）細胞質膜を標識す
3.1. 正常乳腺
3対照例では、すべての安静時および増殖性基底上筋上皮細胞は、p63、CK14、Α-SMA、およびVIMによって標識された。 安静時および増殖性基底上筋上皮細胞は、いずれの場合もCK19を発現しなかった。
3.2. 乳腺腫瘍の同じラインからの乳腺組織
腫瘍と同じラインの29の正常組織において、すべての安静時および増殖性基底上筋上皮細胞をp63、CK14、Α-SMA、お CK5/6はすべてが四つのケースで陽性であり、ERは12のケースで検出されました。 CK19発現は、管腔上皮でのみ観察された。 筋上皮運動性間質細胞は観察されなかった。 全ての結果を表２に要約する。
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| *−：染色された細胞なし;±：5％未満の陽性細胞;+：5−50％陽性細胞;++：50％以上の陽性細胞。 °:運動性音型は存在しないため更新されません。 §：基底上の音型は、管腔細胞の周りに検出できないため更新されません。 |
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ck14は、静止細胞で23例（複合癌1例、良性および悪性筋上皮腫瘍を除く）、増殖細胞で22例（良性混合腫瘍で6例、複合癌15例）で陽性を示し、これらの細胞が紡錘細胞のより運動性の表現型を獲得したときに発現を失う傾向があった（良性混合腫瘍で2例、悪性筋上皮腫瘍で3例、良性混合腫瘍で2例、複合癌で2例）。 混合腫ようの軟骨細胞は陰性であった。
VIMは、良性腫瘍および複合癌における癌の23例およびすべての29例における運動性筋上皮細胞における基底上細胞において陽性であった。 間質細胞は全例陽性であった。 軟骨は、良性混合腫瘍のすべての7癌においてVIM陽性であった。
α-SMAは、良性混合腫瘍および複合癌における23癌における安静時および増殖性基底上筋上皮細胞を標識した。 10例（良性混合腫瘍における5癌および5複合癌）の紡錘細胞は、Α-SMAの陽性を示した。 二つの複合癌を除いて，星状細胞は陰性であった。 間質はわずか6例（良性混合腫瘍の1癌および5複合癌）で陽性を示した。
p63は、良性混合腫瘍および複合癌における癌の23例の安静時および増殖性基底上筋上皮細胞で検出された。 全ての紡錘形および星状運動細胞は陰性であった。 間質細胞および軟骨は陰性であった。
ER発現は11基底上筋上皮細胞（良性混合腫瘍における4癌および7複合癌）に存在していた; 紡錘および星状運動細胞は9例（良性混合腫瘍における3癌および6複合癌）で陽性であった。 混合腫ようの軟骨は陰性であった。
安静時および増殖性基底上および紡錘/星状運動性筋上皮細胞は、検査された腫瘍のいずれにおいてもCK19を発現しなかった。 混合腫瘍の軟骨もCK19に対して陰性であった。
4. 議論
Gamaらの調査結果に基づいて。 および立山ら。 、乳腺には四つの形態学的タイプの筋上皮細胞が存在する: 休止および増殖性基底上筋上皮細胞は、肺胞および管および紡錘形および星状の間質運動細胞を裏打ちし、それらは巣に配置され得る間質空間に P63、CK5/6、CK14、Α-SMA、およびVIMなどの筋上皮マーカーは、複合増殖および混合増殖の評価を容易にするための貴重な診断補助剤であることが判明した。 CK19は管腔の上皮のための金本位のマーカーとして考慮され、myoepithelial細胞との誤診を避けるのに使用されていました。 交差反応性パターンと病変病巣は、典型的には分であるという事実のために、筋上皮マーカーのどれも筋上皮細胞の100％の感度と特異性を享受しませんでした。 そのため、任意の焦点を評価するためには、少なくとも2つのマーカーを使用する必要があります。
我々の結果に基づいて、基底上細胞のための最良のマーカーは、特に成熟（基底）筋上皮細胞に限定されたCK14と関連してp63であり、ck5/6、Α-SMAおよびVIM（図1）に続いてより少ない程度であった（図1）。 しかし、CK5/6はまた、それが困難な増殖性基底上筋上皮細胞からそれらを区別することを作る管腔上皮細胞をマークしました。 形態学的には、上皮細胞および筋上皮細胞の両方が多角形を有していてもよい。 CK14とCK5/6の両方の特性ではなく、p63、Α-SMA、およびVIMの、基底上増殖状態における筋上皮細胞におけるそれらの減少した発現であった。 CK14、CK5/6、およびp63の発現は、紡錘体および星状運動状態の細胞で徐々に失われた。
Α-SMAとVIMは、強度の程度が異なる紡錘形運動性筋上皮細胞に存在していた。 ＶＩＭのみが星状運動性筋上皮細胞の一貫したマーカーであることが分かった。 本研究では，星状運動性筋上皮は巣に配置され，肺胞起源と思われる静止細胞によって並んでいた。 この特徴は，主筋上皮基底上マーカーの発現を失ったが，ＶＩＭに対する親和性を保持している星状運動性筋上皮細胞の巣が軟骨の前駆体であり，これらの細胞が間葉系要素への変換を完了したことを示すという考えを支持すると考えられる。 良性および悪性筋上皮腫瘍では、すべてのケースでVIMラベリング、他のすべての基底上筋上皮マーカーの損失、および紡錘細胞におけるCK14への乏しい陽性は、筋上皮運動状態の支配的な発現と間葉線維芽細胞への単純な筋上皮細胞からの可能な通過を示していた。
私たちの研究では、ck14、CK5/6、およびp63発現の損失によって示される間葉系表現型にシフトする筋上皮細胞の証拠は、Α-SMA、筋上皮細胞と筋線維芽細胞の両方のマーカーのための紡錘細胞の不連続標識によって強化された、完全におそらく線維芽細胞になっている星状運動細胞で失われた。
津田らによる更なる確認研究。
CK14発現の残党を有する筋線維芽細胞の発生を報告した（”変換された筋上皮細胞”として記載されている）。 本研究で調べた症例では、CK14は徐々に退色し、したがって（myo-）上皮表現型の喪失を示す。 これらの結果は，筋上皮間葉転換（ＭＭＴ）を受ける筋上皮様状態を含むＥＭＴ仮説を支持する。 この仮説は、gärtnerらによって犬で確認された。 whoは、乳腺腫瘍において、間葉系細胞の進化におけるステップの一つは、典型的な筋上皮形質の発現を伴うと述べた。
本研究の興味深い結果は、良性混合腫瘍および複合癌における癌の12/29基底上筋上皮細胞および9/29星状細胞に見られるERに対する陽性であった。 ER受容体の二つのアイソフォーム、すなわちER-αおよびER-βが記載されており、後者は単離された基底-筋上皮細胞の核で発現される唯一の形態である。 管腔細胞と基底／星細胞の両方が標識され，おそらく管腔細胞はER-αによって標識され，基底／星細胞はER-βによって標識された。
結論として、基底上筋上皮細胞は、p63およびCK14によってよく特徴付けられ、使用された他のマーカーによってより少ない程度であった。 その代わりに、運動性筋上皮細胞は、Α−ＳＭＡおよびＶＩＭ、ならびにＣＫ１ ４、ＣＫ５／６およびｐ６ ３の喪失によって特徴付けられる（図２）。 本研究はまた、管腔上皮および基底上/星状筋上皮細胞（症例の約半分で後者）の両方でERを示し、ER発現は休止/運動期によって影響されないことを示した。 したがって、シリアルまたはmultistainedセクションでは、P63とCK14と組み合わせてERへの免疫組織化学は、犬の乳腺腫瘍における管腔または筋上皮細胞の誤同定を避けるために役立つ可能性があります。 紡錘細胞における保存されたΑ-SMAおよびVIM発現の傾向、および星状運動細胞における唯一のVIM陽性だけでなく、両方の運動型におけるp63発現の減少は、MMTにおける筋上皮様状態を含むEMTの仮説を支持している。 紡錘形運動性細胞は星状細胞よりも間葉系表現型に向かって早い形質転換と考えられた。
著者の貢献
これらの著者は、この作品にも同様に貢献しました。
利益相反
著者らは、競合する利益を持たないと宣言している。
謝辞
著者は英語のテキストを編集してくれたAnne Collinsさんに感謝します。
補足材料
補足表1：免疫組織化学的結果。
補足表2：年齢、品種および臨床所見。
- 補足資料