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RNase H

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Rnase Hの活性化

rnase Hは、RNA–DNA二重鎖のRNA鎖を分解するユビキタスな酵素である。 それは、ウイルスおよびヒト細胞と同様に多様な生物において同定されている（CrouchおよびDirksen、1985）。 真核細胞では少なくとも２つのクラスのＲｎａｓｅ Ｈが同定されている。 Ｒｎａｓｅ Ｈ活性を有する複数の酵素が原核生物において観察されている（Ｃｒｏｕｃｈ ａｎｄ Ｄｉｒｋｓｅｎ，１ ９ ８ ５）。 RNase HはDNA複製に関与しているが、それは細胞内で他の役割を果たす可能性があり、細胞質および核に見出される（Crum et al., 1988). しかし、核内の酵素の濃度はより大きいと考えられ、細胞質調製物中に見出される酵素のいくつかは核漏れによるものである可能性がある。RNase Hの正確な認識要素は知られていない。

しかしながら、四量体ほど短いＤＮＡ様特性を有するオリゴヌクレオチドは、Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化することができることが示されている（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ、１ ９ ７ ９）。 糖の変化は、ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド、例えば２’−フルオロまたは２’−メトキシを生じる糖修飾が、Ｒｎａｓｅ Ｈの基質として機能しないように見えるので、Ｒｎａｓｅ Ｈ活性化に影響を及ぼす（Ｓｐｒｏａｔ ｅ ｔ ａ ｌ． １ ９ ８ ９；Ｋａｗａｓａｋｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1993). 塩基に対する糖の配向の変化はまた、α-オリゴヌクレオチドがRNase Hを誘導することができないか、または並行アニーリングを必要とし得るため、RNase H活性化に影響を与える可能性がある(Gagnor et al. ら、１ ９ ８ ９；Ｍｏｒｖａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1991). さらに、骨格修飾は、rnase Hを活性化するオリゴヌクレオチドの能力に影響を与える。 メチルホスホネートは、Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化しない（Ｍａｈｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． 1989年、ミラー、1989年）。 対照的に、ホスホロチオ酸塩は優れた基質である（Ｃａｚｅｎａｖｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ８ ９；Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，１ ９ ９ １；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ，１ ９ ９ ３）。 さらに、キメラ分子は、ＲＮＡに結合し、Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化するオリゴヌクレオチドとして研究されている（Ｆｕｒｄｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ８ ９；Ｑｕａｒｔｉｎら、１ ９ ８ ９；Ｎａｔｕｒｅ．, 1989). 例えば、２’−メトキシホスホン酸塩の翼と５塩基ギャップのデオキシオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチドは、それらの標的ＲＮＡに結合し、Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化する（Ｆｕｒｄｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）。 ら、１ ９ ８ ９；Ｑｕａｒｔｉｎら、１ ９ ８ ９；Ｎａｔｕｒｅ．, 1989). さらに、デオキシリボヌクレオチドの配列中の単一のリボヌクレオチドは、その相補的なデオキシ-オリゴヌクレオチドに結合した場合、RNase Hの基質としＲｎａｓｅ Ｈを活性化し、それらのＲＮＡ受容体に対してより大きな親和性を有し、特異性を増強するように設計されたキメラオリゴヌクレオチドを利用することが可能であることもまた実証されている（Ｇｉｌｅｓ ａｎｄ Ｔｉｄｄ，１ ９ ９ ２；Ｍｏｎｉａ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ９ ２；Ｍｏｎｉａ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ９ ３；Ｍｏｎｉａ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ９ ４；Ｍｏｎｉａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1993). ある研究では、メチルホスホネートのデオキシオリゴヌクレオチド翼とホスホジエステルギャップからなるデオキシオリゴヌクレオチドを完全なホスホジエステルオリゴヌクレオチドと比較した場合、RNase Hを介した標的転写物の切断ははるかに選択的であった（Giles and Tidd,1992）。

RNase Hに関する情報と、多くのオリゴヌクレオチドがライセートおよび精製酵素アッセイにおいてRNase Hを活性化する可能性があることの実証にもかかわらず、RNASE Hを活性化する際のRNA標的における構造的特徴の役割については比較的ほとんど知られていない(Minshull and Hunt,1986;Gagnor et al., 1987; ＷａｌｄｅｒおよびＷａｌｄｅｒ，１ ９ ８ ８）。 実際には、RNase H活性化が実際には細胞内のオリゴヌクレオチドの作用機序であるという直接的な証拠は、ごく最近まで欠けていた。私たちの研究室での最近の研究は、間接的ではあるが、これらの質問に対する追加の洞察を提供しています。

ＩＳＩＳ１ ９ ３ ９は、ＩＣＡＭ−１ＲＮＡの３’非翻訳領域中の配列に相補的な２ ０ｍｅｒのホスホロチオエートである（Ｃｈｉａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1991). それは人間の臍静脈のendothelial細胞のICAMの生産を禁じ、ICAM-1mRNAが急速に低下することをノーザンブロットは示します。 ISIS1939の2′-メトキシ類似体は、ホスホロチオエートよりもRNAに対する高い親和性を示し、細胞内で安定であるが、ISIS1939よりもICAM-1タンパク質産生をはるかに 対照的に、ISIS1570、ICAM-1メッセージの翻訳開始コドンに相補的である18-merホスホチオエートは、タンパク質の産生を阻害したが、RNAの分解を引き起こさなかった。 したがって、Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化することができる２つのオリゴヌクレオチドは、それらが結合するｍＲＮＡ中の部位に依存して異なる効果を有した（Ｃｈｉａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1991). Ｒｎａｓｅ Ｈが多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性における重要な因子である可能性が高いというより直接的な実証は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理された細胞におけるｂｃｒａｂｌ ｍ ＲＮＡからの切断産物を同定するために逆連結ＰＣＲを使用した研究によって提供された（Ｃｒｏｏｋｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1995).

標的RNAとヌクレアーゼの安定性とRNASE Hの基質として機能するDNA型ギャップに対する親和性を高めるために設計された3′-および5′-翼の修飾を伴うキメラオリゴヌクレオチドの新たな役割を考えると、酵素の効率に及ぼす様々な修飾の影響を理解することに焦点を当てた研究もかなり重要である。 大腸菌RNase Hに関するそのような研究の1つでは、本発明者らは、この酵素が最小の配列特異性を示し、遺伝性であることを報告している。 翼の2’修飾された糖を持つキメラオリゴヌクレオチドがRNAにハイブリダイズされたとき、切断の最初のサイトは、RNA基質の3’末端に最も近いメトキシ-デオキシ接合に隣接するヌクレオチドであった。 開裂の初期速度は、DNAギャップの大きさが増加するにつれて増加し、酵素の効率は、完全なDNA型オリゴヌクレオチドよりもキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドと二重化されたRNA標的に対してかなり少なかった（Crooke et al., 1995).

その後の研究では、構造化および非構造化標的とのアンチセンスオリゴヌクレオチドの相互作用、およびRNase Hに対するこれらの相互作用の影響をより詳細に評価している（Lima and Crooke、1997）。 非開裂基質とMichaelis-Menten分析のシリーズを使用して、我々は結合と開裂の両方を評価することができました。 我々は、実際には、大腸菌RNase H1は、二本鎖RNA結合タンパク質であることを示した。 ＲＮＡ二重鎖のためのＫｄは１.６μ Ｍであり；ＤＮＡ二重鎖のためのＫｄは１ ７ ６μ Ｍであり；一本鎖ＤＮＡのためのＫｄは９ ４ ２μ Ｍであった。 対照的に、この酵素は、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡのみを切断することができた。 切断部位でのアンチセンス薬の任意の2′-修飾は切断を阻害したが、有意な電荷減少および2′-修飾は結合部位で許容された。 最後に、アンチセンス薬に正の電荷（例えば2′-プロポキシアミン）を配置すると、親和性と切断が減少した。 我々はまた、大腸菌RNase H1の活性に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導RNA構造の効果を検討している（LimaとCrooke、1997）。 二重基材中の任意の構造は開裂速度に有意な負の効果を有することが分かった。 さらに、選択された部位の切断は完全に阻害され、これは、副溝または主溝またはヘテロ二重のいずれかを横断するRNAループによって課される立体障害に 最近、我々はクローン化し、ヒトRNase H1を発現しています。 このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ Ｈ１と相同であるが、ヒトＲｎａｓｅ Ｈ２型について記載されたものと同様の特性を有する（Ｆｒａｎｋ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ４；Ｗｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998). この酵素は、低濃度のMg2+によって刺激され、高濃度によって阻害され、Mg2+の存在下でMn2+によって阻害される。 分子量は33kDaである。 それは二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質であり、切断のための独特の位置および配列選好を示す（Ｗｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). さらに、ヒトＲｎａｓｅ Ｈ２はクローニングされているが、現在までに発現されたタンパク質は活性であることが示されていない（Ｆｒａｎｋ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998). ごく最近、本発明者らは、ヒトＲｎアーゼＨ１に導入されたいくつかの変異が酵素の活性に及ぼす影響について報告している（Ｗｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2000). このように、我々は今、生物学的および薬理学的プロセスにおけるヒトRNase Hの役割を探求し、より効果的にそれらと相互作用するように設計された薬の開発を開始するために開始するために必要なツールを持っています。

最後に、少なくとも標的RNAのRNase H誘導分解に関して、我々は最近、細胞当たりRNAの1-150コピーの範囲で、標的RNAのレベルはアンチセンス阻害剤の効力に影 これは、細胞当たりのアンチセンス薬物の分子数がRNAのコピー数を数桁上回るという事実による。 したがって、他の要因はレート制限でなければなりません。