TR-1003-G Sigma-AldrichPolybrene感染/トランスフェクション試薬
哺乳類細胞への遺伝子導入の非常に効率的な方法は、レトロウイルスベクターによる感染によるものである。 レトロウイルス感染の効率は、感染中にポリブレンを含めることによって、いくつかの細胞で100-1,000倍に有意に増強される。 DMSOショックを伴うポリブレンは、CHO、ニワトリ胚線維芽細胞、NINH−3T3および骨髄細胞などの種々の細胞型へのDNA移動を媒介するためにも使用される。
プロトコル: レトロウイルス感染
組換えレトロウイルス株は、100mmプレート内のトランスフェクションされたレトロウイルス包装細胞のほぼ合流単分子層に5%血清と増殖培地の5mlを追加することによって調製される。 24時間後、培地を除去し、0.45umフィルターを通して濾過する。
この組換えレトロウイルス株に感染する細胞は、500,000細胞/100mmプレートで10mlの完全な培地にめっきされています。
24時間後、細胞から増殖培地を除去する。 Ml(最終濃度)あたり5ugから10ugのポリブレンの存在下で、ウイルス上清の2ml(またはウイルスストックの2mlへの希釈)で細胞を感染させる。 細胞を3-6時間37℃でインキュベートする。
8mlの完全培地を加える。 感染の3日後に、細胞を1:5で選択培地に分割する。
Toyoshima,K.and Vogt,P.K.,1969. ウイルス学 38:414-426
Coelen,J.R.,Jose,D.G.and May,J.T.1983. アーチ ヴィロール 75:307-311
プロトコル:トランスフェクション
完全な成長培地中で約50%の合流点でプレート細胞。
めっき後18-24時間、DNA-培地-ポリブレン溶液を準備し、次のように使用する直前に:
注:各成分は適切な順序で添加する必要があります。
第1回:完全増殖培地(2mlsは60mmプレート、3mlsは100mmプレート)を37℃に温めた。
第2回:プラスミドDNA、10ng-10ug。 静かに混ぜる。
第3回:ポリブレンをmlあたり5ug-10ugの最終濃度にする。 穏やかに混合
プレートから培地を除去し、細胞にDNA-培地-ポリブレン溶液を追加します。 細胞を37℃で6-20時間インキュベートし、約1時間ごとに時折穏やかなロッキングを行います。最初の5時間は6時間。
DNA-培地-ポリブレン溶液を除去し、DMSOショック溶液(15%DMSO in1X HBSS:Specialty Media catalog#S-051-D)3mls/60mmディッシュおよび4mls/100mmプレートで細胞を静かにオーバーレイ。 手動で均等に溶液を配布するために10秒間皿をロックし、その後、正確に4分間細胞をインキュベート37℃で
すぐにDMSOショック溶液を削除し、静かに完全な成長培地、5mlsあたり60mm皿、10mlsあたりの洗浄あたり100mm皿
細胞に完全な成長培地を追加します。
安定な形質転換体の場合は、増殖培地を除去し、細胞を1:5選択培地に分割する。
一過性の発現のために、成長培地を除去し、新鮮な成長培地を追加します。 細胞および/または培地を2 4〜7 2時間後に収穫する。
Chaney,W.G.et al., 1986. 体細胞および分子遺伝学。 Vol. 12,No.23,
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