przygotowanie macierzy pozakomórkowej i reologia

ECM składa się z sieci żelatyny i fibryny. Aby przygotować składniki ECM, najpierw wytwarza się roztwór żelatyny o stężeniu 15 wag/v% (Typ A, 300% ze skóry świni, Sigma) przez dodanie proszku żelatyny do ciepłego roztworu (70 °C) DPBS (1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbelco bez wapnia i magnezu). Żelatynę pozostawia się do całkowitego rozpuszczenia przez mieszanie przez 12 godzin w temperaturze 70 °C, a następnie pH dostosowuje się do 7,5 przy użyciu 1 M NaOH. Roztwór jest sterylnie filtrowany i przechowywany w temperaturze 4 °C w równych ilościach do późniejszego wykorzystania w odlewaniu (<3 miesiące). Roztwór fibrynogenu (50 mg/mL) Wytwarza się przez rozpuszczenie liofilizowanego białka osocza krwi bydlęcej (Millipore) w temperaturze 37 °C w sterylnych DPB bez wapnia i magnezu. Roztwór przechowuje się w temperaturze 37 °C bez mieszania przez co najmniej 45 minut w celu całkowitego rozpuszczenia. Roztwór transglutaminazy (TG) (60 mg/mL) Wytwarza się przez rozpuszczenie liofilizowanego proszku (Moo Gloo) w DPB bez wapnia i magnezu i delikatne mieszanie przez 20 sekund. następnie roztwór utrzymuje się w temperaturze 37 °C przez 20 minut i sterylnie filtruje przed użyciem. Roztwór podstawowy CaCl2 (250 mM) otrzymuje się przez rozpuszczenie proszku CaCl2 w DPB bez wapnia i magnezu (Corning). W celu przygotowania podstawowego roztworu trombiny, liofilizowaną trombinę (Sigma Aldrich) rozpuszcza się w 500 j./mL przy użyciu sterylnych DPB i przechowuje w temperaturze -20 °C. stężenia trombiny rozmraża się bezpośrednio przed użyciem.

do pomiarów reologii atramentu wykorzystywany jest kontrolowany reometr naprężeniowy (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) o średnicy 40 mm, stożku 2° i geometrii płytki. Moduły magazynowania ścinania (G’) i strat (G”) są mierzone z częstotliwością 1 Hz, a odkształcenie oscylacyjne (γ) wynosi 0,01. Pomiary czasowe przeprowadza się przez szybkie umieszczenie wstępnie zmieszanego roztworu ECM zawierającego trombinę na płytce Peltiera utrzymywanej w temperaturze 37 °C.

formulacje atramentu

do bioprintowania 3D perfusowalnych modeli PT wymagane są dwa atramenty. Jeden atrament, który jest używany do wytworzenia uszczelki chipu perfuzyjnego, składa się z dwuczęściowego elastomeru silikonowego (SE 1700, DOW Chemical) z zasadą 10:1 do katalizatora (wagowo), który jest homogenizowany za pomocą mieszalnika odśrodkowego przez 2 minuty (2000 obr. / min, AE-310, Thinky Corp, Japonia). Atrament silikonowy jest drukowany w ciągu 2 godzin od wymieszania z katalizatorem. Ten atrament jest ładowany do strzykawki (EFD Inc., East Providence, RI) i odwirować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza przed drukowaniem w temperaturze pokojowej. Drugi atrament, farba ulotna używana do drukowania kanalika, składa się z 38% wagowych Pluronic F127 (Sigma) i 100 J/mL trombiny w dejonizowanej, ultrafiltrowanej (DIUF) wodzie. Farbę ulotną farbuje się na różowo przez dodanie barwnika reaktora ryzyka do wizualizacji na Fig. 1 i Film S1. W celu wytworzenia tego atramentu, 40% wagowo Pluronic f127 roztwór w wodzie homogenizuje się za pomocą mieszalnika Thinky do momentu całkowitego rozpuszczenia proszku, a następnie przechowuje się go w temperaturze 4 °C. Przed użyciem do uchodzącego (Pluronowego) atramentu dodaje się roztwór trombiny o stężeniu 2000 j/mL w stosunku 1:20 i homogenizuje za pomocą mieszalnika thinky. Ulotny atrament jest następnie ładowany do strzykawki (EFD Inc., East Providence, RI) w temperaturze 4 °C i odwirować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Przed wydrukowaniem tusz ten jest równoważony w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.

Bioprinting perfusable 3D proximal tubule constructs

3D PT constructs are fabricated using a custom-designed, multimaterial 3D bioprinter equipped with four independently addressable printheads monted on a 3-axis, motion-controlled gantry with a build volume 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Atramenty są umieszczone w oddzielnych cylindrach strzykawkowych, do których dysze o różnych rozmiarach (tj. o średnicy 50 µm–410 µm) są mocowane za pomocą luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Atramenty są wytłaczane przez dysze do osadzania, stosując ciśnienie powietrza (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, USA), w zakresie od 10-90 psi, co odpowiada prędkościom druku od 1 mm/s do 5 cm/s. najpierw drukujemy spersonalizowaną uszczelkę wiórów perfuzyjnych, nanosząc atrament silikonowy przez stożkową dyszę 410 µm na szklane szkiełka o wymiarach 50 mm × 75 mm. Projekt uszczelki jest tworzony przy użyciu niestandardowego skryptu MATLAB, który generuje kod G dla ostatecznej struktury uszczelki. Po wydrukowaniu uszczelkę Chipa perfuzyjnego utwardza się w temperaturze 80 °C w piekarniku przez >1 h i przechowuje w temperaturze pokojowej przed użyciem.

wzór 3D PTs w chipie perfuzyjnym wymaga połączenia odlewania ECM i drukowania ulotnego atramentu. Po pierwsze, roztwór ECM powstaje przez połączenie 10 mg/mL fibrynogenu, 7,5% wagowych żelatyny, 2,5 mM CaCl2 i 0,2% wagowych TG. Roztwór ten jest następnie równoważony w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut przed użyciem w celu poprawy jasności optycznej ECM25. Następnie roztwór szybko miesza się z trombiną w stosunku 500:1, uzyskując końcowe stężenie trombiny 1 U / mL. W ciągu 2 minut w temperaturze 37 °C następuje polimeryzacja fibrynogenu w żel fibrynowy. Z tego powodu roztwór ECM musi być odlany na podstawę Chipa perfuzyjnego natychmiast po zmieszaniu z trombiną. Podstawową warstwę ECM pozostawia się następnie lekko do wyschnięcia pod azotem, tworząc płaską powierzchnię. Ulotny atrament Pluronic F127 (z trombiną 100 U/mL) jest drukowany na podstawowej warstwie ECM w postaci zwiniętej folii (tubule) za pomocą stożkowej dyszy 200 µm. Niestandardowy skrypt Pythona (MeCode) jest używany do określenia ścieżki narzędzia w G-code. Bezpośrednio po druku atramentowym, metalowe wydrążone kołki perfuzyjne przeplatane przez uszczelkę silikonową wchodzą w kontakt z drukowanym atramentem. Górna warstwa ECM jest następnie formowana przez odlewanie roztworu ECM na wydrukowaną rurkę, jak opisano powyżej, w odległości 1-2 mm od wysokości ścianek uszczelki. Jeśli komórki, takie jak Hndf, są włączone do ECM (rys. S5), miesza się je bezpośrednio po okresie równowagi, przed zmieszaniem trombiny i późniejszym odlewaniem. Po odlaniu górnej warstwy ECM konstrukcja jest pokryta szkiełkiem, aby zapobiec parowaniu lub zanieczyszczeniu i jest utrzymywana w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić zakończenie polimeryzacji fibryny i usieciowanie sieci TG. Konstrukcja jest następnie chłodzona do 4 °C przez 15-20 minut w celu upłynnienia drukowanego atramentu ulotnego, który jest wypłukiwany z urządzenia za pomocą zimnych mediów komórkowych, pozostawiając otwarte przewody, które służą jako pożądana sieć rurowa osadzona w ECM z komórkami lub bez komórek w przestrzeni ECM.

korzystając z tej metody, stworzyliśmy również architektury 3D w sekwencji budowania warstwa po warstwie. Na przykład każda pojedyncza warstwa trójwarstwowej struktury pokazanej na Fig. S10 został skonstruowany przy użyciu zmodyfikowanego protokołu drukowania, który zawiera materiały i metody wcześniej omówione. Po wydrukowaniu pierwszych kanalików farbą ulotną na wydruk nakłada się warstwę ECM i dopuszcza się 20 minut żelowania w temperaturze 37 °c, Zanim Następna bliższa warstwa kanalików zostanie wydrukowana farbą ulotną na wierzchu niedawno zżelowanej warstwy. Ta kolejna konstrukcja wprowadza geometrię 3D i umożliwia skuteczne ewakuowanie wszystkich kanałów niezależnie po zakończeniu budowy. Wodne barwniki reaktora ryzyka są perfuzowane przez kanały i wzbudzane światłem UV w celu wizualizacji.

aby zakończyć proces montażu chipów tkankowych 3D, każda konstrukcja PT jest umieszczana na obrabianej podstawie ze stali nierdzewnej, a na górze umieszczona jest gruba akrylowa pokrywa. Pokrywa i podstawa są zaciśnięte razem za pomocą czterech śrub, tworząc uszczelkę wokół drukowanej uszczelki silikonowej. Następnie sterylny dwuetapowy przewód perystaltyczny (PharMed BPT, średnica wewnętrzna 0,25 mm) jest wypełniany mediami i podłączany do wylotu sterylnego filtra, który jest przymocowany do cylindra strzykawki o pojemności 10 ml (EFD Nordson), który służy jako zbiornik mediów. Pożywki PTEC (przeznaczone do wzrostu, a więc preparat ATCC plus 1% FBS, 1% aprotyniny i 1% Anty-anty), które równoważono przez >3 h W Inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 dodaje się do zbiornika pożywki, a przewody ze zbiornika są podłączone do wylotu Chipa (metalowy drążony kołek perfuzyjny). Strzykawka jest następnie używana do wywierania lekkiego nacisku na media w lufie, zmuszając ją do wejścia i całkowitego napełnienia dołączonego przewodu. Napełnianie rurki mediami przed podłączeniem do obwodu zapobiega wprowadzeniu pęcherzyków powietrza do systemu. Aby zakończyć Obwód perfuzji, rurki silikonowe ze zbiornika są podłączone do wlotu metalowego kołka perfuzyjnego na chipie. Na wlocie i wylocie Chipa perfuzyjnego dodaje się zaciski zaciskowe do węża, aby zapobiec niekontrolowanemu przepływowi po odłączeniu od pompy perystaltycznej, co może uszkodzić nabłonek lub umożliwić przedostanie się pęcherzyków powietrza do systemu. Zbiornik mediów jest przez cały czas równoważony z warunkami atmosferycznymi w inkubatorze za pomocą sterylnego filtra na górze zbiornika mediów.

Kultura komórkowa

ludzkie uwiecznione PTECs (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) są hodowane zgodnie z instrukcjami ATCC i są używane do wszystkich badań modelu PT do przejścia 20. Do analizy ekspresji genów, ludzkie pierwotne RPTEC (Cell Science), immortalized PTECs (RPTEC-TERT1, Evercyte) i a498 (ATCC HTB-44) komórki raka nerki są używane i hodowane zgodnie z instrukcjami dostawcy. Ludzkie neonatalne fibroblasty skórne (HNDF), ekspresja GFP (Angio-Proteomie) są hodowane zgodnie z instrukcjami dostawcy i używane do przejścia 15.

analiza ekspresji genów

ludzkie pierwotne RPTEC (Cell Science), uwiecznione RPTEC-TERT1 (Evercyte) i a498 (ATCC HTB-44) komórki raka nerki są hodowane w 96-studzienkowych płytkach zgodnie z instrukcjami dostawcy i zbierane w dniu 3 po zbiegu przez zastąpienie podłoża hodowlanego 100 µl / studzienkę mieszaniny lizy 1x RNA (Quantigene Sample Processing Kit, QS0101). Następnie 40 µl lizatu miesza się z magnetycznym zestawem kulek wychwytujących mRNA (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, numer katalogowy 312631), inkubuje przez noc, przetwarza do amplifikacji rozgałęzionych DNA i analizuje zgodnie z instrukcjami producenta (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). Sonda PPIB jest wykorzystywana jako gen do normalizacji. Dane dotyczące intensywności fluorescencji (FI) przedstawiono jako średnie i standardowe odchylenie 3 replikatów biologicznych.

analiza cytokin perfuzatu nośnika

perfuzat nośnika jest pobierany z kanalika przez okres 25 dni po wysiewie komórek i przechowywany w temperaturze -80 °C przed analizą. Do profilowania cytokin supernatanty rozmraża się na lodzie, rozcieńcza 2x w buforze do rozcieńczania próbki (BioRad catalog #M60-009RDPD) i analizuje metodą ELISA opartą na technologii Luminex przy użyciu ludzkiej chemokiny Bio-Plex Pro™ IL-6 (Set #171bk29mr2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) i MCP-1 (Set #171-BK36MR2) oraz Bio-Plex Pro™. 200 systemów (biorad) wg instrukcji producenta. Dane podaje się jako średnie stężenia cytokin i odchylenia standardowe trójplikatów technicznych.

epitelializacja i kultura podłużna

każda konstrukcja 3D PT jest perfuzowana przez kilka godzin z mediami PTEC w inkubatorze przed załadowaniem / wysiewem komórek. Ptec (PTEC / TERT1, ATCC) trypsynizuje się z naczynia hodowlanego i zatęża w pożywce do ~2 × 107 komórek/mL. Zawiesina komórki jest następnie ładowana do układu perfuzyjnego przez wylot (rys. S3b, c). Załadowana konstrukcja jest umieszczana poprzecznie w inkubatorze na kilka godzin i obracana o 180° W ciągu wielu półgodzinnych odstępów, aby umożliwić równomierne zasiewanie ścian kanalika, a następnie inkubowana w kanaliku bez przepływu przez noc. Następnego dnia, nie przylegające komórki są wypłukiwane z kanalika pod przepływem grawitacyjnym. Następnie rozpoczyna się perfuzja świeżych mediów, a pozostałe komórki zaczynają gromadzić się, a następnie wyrastać z tych kolonii (Fig. S3f) aż do osiągnięcia zbiegu po około 3 tygodniach od wysiewu (rys. S3k). W fazie wzrostu Ptec są karmione pożywką ptec przygotowaną zgodnie z wytycznymi ATCC plus 1% aprotyniny (EMD Millipore, stosowana do spowolnienia degradacji ECM), 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego (Gibco). Po dojrzewaniu FBS jest usuwany, a PTECs pakuje się w szczelną jednowarstwę nabłonkową (film S2). W pierwszym dniu po wysiewie Ptec są narażone na ciągły, jednokierunkowy przepływ z prędkością 1 µl / min, co odpowiada naprężeniom ścinającym, które wahają się od 0,1 do 0,5 Dynów/cm2 w zależności od przekroju kanalika. Media są podawane przez pompę perystaltyczną w obiegu zamkniętym i wymieniane co 2 dni.

badanie wychwytu Albumin

wychwyt Albumin jest oceniany dla drukowanych modeli 3D PT oraz dla kontroli 2D. Pierwsza kontrola składa się z PTECs uprawianych na plastikowych hodowlach tkankowych, podczas gdy druga kontrola składa się z PTECs uprawianych na naszym ECM. W każdym przypadku Pteks są uprawiane do zbiegu i mogą dojrzewać w surowiczych wolnych mediach. Albumina surowicy ludzkiej skoniugowana z FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) jest zawieszona w pożywce PTEC w dawce 50 µg/mL. Wszystkie próbki są inkubowane z HSA-FITC w ich pożywce przez 2 godziny (w przypadku perfuzji perfuzja jest perfuzowana przez otwarte światło). Po ekspozycji wszystkie próbki przemywa się 3-krotną objętością, a następnie trypsynizuje 10-krotną trypsyną w celu zebrania poszczególnych komórek. Komórki są utrwalane i przeciwstawiane pierwotnymi i wtórnymi przeciwciałami dla megaliny (tabela S2 zawiera wykaz użytych specyficznych przeciwciał). Komórki z tych próbek i komórki nagie są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (BD LSR Fortessa) i dane są zbierane z N = 10 000 komórek na próbkę. Aby uzyskać obrazy HSA-FITC i megalin w PTECs, próbki są mocowane na miejscu za pomocą formaliny, zamiast być tryzynizowane po etapie mycia. Próbki te są porównywane do megalinu i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej (Zeiss Lsm710).

testowanie cyklosporyny A

zbadano wpływ CysA zarówno na kontrole 2D, jak i Bioprinted 3D PTs. W 2D komórki są wysiewane w formacie 96-studzienkowym na plastiku do hodowli tkankowej i hodowane do zbiegu. Są karmione zgodnie z wytycznymi ATCC. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) jest zawieszony w ich pożywce w różnych stężeniach i inkubowany z komórkami przez 24 godziny. test żywotności z użyciem(3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2h-tetrazolium) w obecności metosiarczanu fenazyny (MTS) przeprowadza się w ciągu 24 godzin po ekspozycji. Test ten kończy się na PTECs we wczesnym konfluencji, dając CysA komórkom w dniu, w którym osiągnęły konfluencję, jak również późnym konfluencji, dając CysA kilka dni po osiągnięciu konfluencji. Należy zauważyć, że wyniki toksyczności są podobne dla każdego przypadku (rys. 5n). W przypadku 3d PTs, CysA jest karmiona w różnych stężeniach przez otwarte światło dojrzałych kanalików po osiągnięciu zbiegu (w ciągu ~3 tygodni), gdzie przez minimum 10 dni nie zawiera się serum w pożywce. W 24 h po ekspozycji na CysA przeprowadza się test szczelności FITC-dekstran (opisany poniżej) w celu oceny i określenia ilościowego zaburzeń funkcji barierowej PTECs. Bezpośrednio po tym, PT jest ustalany przy użyciu 10% buforowanej formaliny przez 1 godzinę i przeciwstawiany dla aktyny i DAPI (tabela S2 wymienia konkretne użyte plamy).

pomiary przepuszczalności dyfuzyjnej

aby ocenić funkcję barierową nabłonka w 3D, przepuszczalność dyfuzyjną określa się ilościowo przez perfuzję mediów PTEC w otwartym świetle zawierającym 25 µg/mL sprzężonego FITC 70 kDa dekstranu (FITC-Dex, produkt Sigma 46945) z szybkością 15 µL/min przez 3 min i 1 µL / min następnie przez ~30-45 min. Cały test przeprowadza się w obrazowaniu żywych komórek zarówno z kanalikiem, jak i otaczającym ECM w polu widzenia (Fig. S9). Wzór dyfuzji FITC-Dex jest wykrywany przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego szerokokątnego (Zeiss Axiovert 40 CFL). Obrazy fluorescencyjne są rejestrowane przed perfuzją i co 3 do 5 minut w okresie 30-45 minut. Przepuszczalność dyfuzyjna FITC-Dex jest obliczana przez ilościowe określenie zmian intensywności fluorescencji w czasie przy użyciu następującego równania 34;

PD to współczynnik przepuszczalności dyfuzyjnej, I1 to średnia intensywność w początkowym punkcie czasowym, I2 to średnia intensywność w t ~ 30-45 min, Ib to intensywność tła (Zdjęcie wykonane przed perfuzją FITC-Dex), A D jest średnicą kanału. Inni badacze donoszą, że PTECs może resorbować dekstran39, co prowadziłoby do nieco wyższych wartości mierzonej przepuszczalności dyfuzyjnej.

badaliśmy również właściwości barierowe naszych kanalików wyłożonych nabłonkiem przy użyciu związku o niskiej masie cząsteczkowej, inuliny (4,5 kDa), która nie jest resorbowana ani wydzielana in vivo przez PTECs przy użyciu tej samej metody opisanej powyżej. Inulina-FITC (produkt Sigma F3272) rozpuszcza się w rozgrzanym środowisku PTEC w ilości 100 µg/mL i perfumuje w otwartym świetle z szybkością 20 µL/min przez 3 minuty, a następnie 1,5 µL/min przez ~15 minut. Cały test przeprowadza się w obrazowaniu żywych komórek zarówno z kanalikiem, jak i otaczającym ECM w polu widzenia (Fig. S7). Wzór dyfuzji inuliny FITC jest wykrywany przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia (Leica). Obrazy fluorescencyjne są rejestrowane za pomocą ogrodzonego Źródła światła i sceny kontrolowanej ruchem przed perfuzją i co 3 do 5 minut w okresie 15 minut w celu zebrania pomiarów technicznych w trzech egzemplarzach.

mikroskopia elektronowa

w przypadku transmisyjnej mikroskopii elektronowej (tem), PTECs w architekturze 2D lub 3D lub zdrowej ludzkiej tkance nerki uzyskanej ze standardowej biopsji przed przeszczepem są utrwalane przy użyciu 2,5% aldehydu glutarowego, 1,25% paraformaldehydu i 0,03% kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze kakodylanowym sodu (pH 7,4) przez co najmniej kilka godzin. Małe próbki (1 mm × 1 mm) usuwa się i przemywa w 0,1 M buforze kakodylowym i skąpia w 1% osmiumtetroksydzie (OsO4) (EMS) i 1.5% potassiumferrocyanidu (Kfecn6) (Sigma) przez 1 godzinę, przemyto w wodzie 3x i inkubowano w 1% wodnym octanie URANYLU (EMS) przez 1 godzinę, a następnie 2 przemyto w wodzie, a następnie odwodniono w różnych stopniach alkoholu (po 10 minut każde; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Następnie próbki umieszcza się w propylenotlenku (EMS) przez 1 godzinę i inkubuje przez noc w mieszaninie 1:1 propylenotlenku i Taab Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kanada). Następnego dnia próbki są osadzane w Taab Epon i polimeryzowane w temperaturze 60 °C przez 48 godzin. Odcinki ultracienkie (około 60 nm) wycinane są na Mikrotomie Reichert Ultracut – s, umieszczane na siatkach miedzianych barwionych cytrynianem ołowiu i badane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym JEOL 1200ex, a obrazy rejestrowane są kamerą CCD AMT 2K. Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą oprogramowania ImageJ.

w przypadku skaningowej mikroskopii elektronowej (sem) perfusowane PTECs w 3D są utrwalane przy użyciu 10% buforowanej formaliny przez 1 godzinę. próbki są cienko pokrojone (~1 mm grubości), aby odsłonić komórki ograniczające otwarte światło. Utrwalacz zmywa się za pomocą PBSx2, a następnie odwodnia w różnych gatunkach etanolu (po 20 minut każdy; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Następnie próbki umieszcza się w 50% etanolu i 50% heksametylodisilazanie (HMDS) przez 30 minut, a następnie w 100% HMDS 3 × 30 minut. Wszystkie czynności wykonywane są w zamkniętym i szczelnym pojemniku szklanym. Po ostatecznym umyciu HMD próbki są usuwane i umieszczane w otwartym pojemniku pod N2 w dygestorium w celu wyschnięcia. Wysuszone próbki są mocowane do aluminiowych mocowań za pomocą przewodzącej taśmy węglowej, sputter pokryty złotem i zobrazowany za pomocą Tescan Vega sem.

Immunostaining

Immunostaining a następnie mikroskopia konfokalna służy do oceny lokalizacji komórkowej białek w modelach 2D i 3D PTEC. Przed immunostaining, każdy konstrukt przemywa się PBS, a następnie utrwala przez 20 min do 1 h przy użyciu 10% buforowanej formaliny. Utrwalacz usuwa się za pomocą kilku płukań w PBS przez kilka godzin, a następnie blokuje przez noc przy użyciu 1% wagowej albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Pierwotne przeciwciała przeciwko białku komórkowemu lub interesującemu biomarkerowi inkubuje się z konstruktami przez 1 dzień w rozcieńczeniach wymienionych w tabeli S2 w roztworze o stężeniu 0,5% wag.BSA i 0,125% wag. Triton X-100. Usunięcie niezwiązanych pierwotnych przeciwciał przeprowadza się metodą przemywania roztworu PBS lub 0,5% wag. BSA i 0,125% wag. Triton X-100 w PBS przez 1 dzień. Przeciwciała wtórne inkubuje się z konstruktami przez 1 dzień w rozcieńczeniach wymienionych w tabeli S2 w roztworze 0,5% wagowych BSA i 0,125% wagowych Triton X-100 w PBS. Próbki są przeciwbarwiane NucBlue lub ActinGreen przez 2 godziny, a następnie myte przez 1 dzień w PBS przed obrazowaniem.

renderowanie i analiza obrazu

mikroskopia kontraktowa fazowa jest wykonywana przy użyciu odwróconego lunety Leica DM IL z celami w zakresie od 1,25 X do 40x. mikroskopia konfokalna jest wykonywana przy użyciu pionowego Zeiss LSM 710 z celami zanurzenia w wodzie w zakresie od 5X do 40x przy użyciu laserów widmowych o długościach fal 405, 488, 514, 561 i 633 nm. Rekonstrukcje obrazów stosów z są wykonywane w ImageJ za pomocą funkcji projekcji z z ustawieniem maksymalnej intensywności pikseli. Każdy wzrost jasności jest przeprowadzany równomiernie na całym wyświetlanym obrazie Z. Rekonstrukcje obrazów 3D i obracanie filmów (Movie S3)są wykonywane za pomocą oprogramowania Imaris. Nowy CytoSMART (Lonza) w systemie inkubatora służy do rejestrowania obrazowania poklatkowego (film S2). Analiza obrazu w celu kwantyfikacji przepuszczalności dyfuzyjnej jest wykonywana przy użyciu niestandardowych skryptów MATLAB z wykorzystaniem wcześniej zgłoszonych metod34. Analiza obrazu TEM jest wykonywana przy użyciu oprogramowania ImageJ w celu pomiaru wysokości komórki (N ≥ 50), gęstości mikrowilli (N ≥ 25) i długości mikrowilli (n ≥ 150) W co najmniej 3 niezależnych próbkach dla każdego warunku.

analiza statystyczna

dane są wyrażone jako średnie ± odchylenie standardowe. Analiza statystyczna jest wykonywana przy użyciu MATLAB i istotność statystyczna jest określana przy wartości p < 0,05, jak określono w ANOVA przy użyciu testu porównawczego wielu par tukeya. Różne poziomy istotności (wartości p) są oznaczone gwiazdkami, a konkretne wartości p są podane w każdej legendzie rysunku.