badani, próbki kliniczne i genotypowanie HLA. Wszystkie osoby, u których w wywiadzie przeprowadzono transfuzję krwi, zostały wykluczone z badania. 32 rodziny z historią twardziny simplex zostały zrekrutowane i badane dla alleli klasy II I klasy i HLA; 3 pokolenia badane były dla 20 rodzin i 2 pokolenia dla 12 rodzin. Dla wszystkich kobiet z dziećmi wymagane były trzy pokolenia, a udział wszystkich dzieci był wymagany, ponieważ mikrochimeryzm mógł pochodzić od matki lub od dziecka w tych badanych. Udział mężczyzn, dzieci i kobiet nigdy nie będących w ciąży obejmował 2 pokolenia (tj. podmiot i matkę). Jeden pacjent z twardziną był bliźniakiem; nienaruszony bliźniak został również zrekrutowany do badania. Zrekrutowano 33 zdrowe rodziny kontrolne, w tym 22 z 3 pokoleniami i 11 z 2 pokoleniami. Przeprowadzono genotypowanie HLA dla łącznie 254 osób: 128 w rodzinach twardziny i 126 w grupach kontrolnych. W celu potwierdzenia przypisania haplotypu HLA włączono kilku dodatkowych członków rodziny. Z tej bazy danych, osoby zostały wybrane do dalszych badań, gdy matka badanego miała nie dzielony allel HLA, który był celem testów specyficznych dla HLA. Wszyscy pacjenci otrzymali świadomą zgodę, zatwierdzoną przez Komisję przeglądu instytucjonalnego Centrum Badań nad Rakiem Freda Hutchinsona.

PBMC wyizolowano z pełnej heparynizowanej krwi przez rozcieńczenie w HBSS, a następnie odwirowano gradientowo Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja) przy 1,077 g/mL. W przypadku niektórych dzieci DNA ekstrahowano z korzeni włosów w celu wpisania HLA, jak opisano wcześniej (9). Genomowy DNA ekstrahowano z PBMC przy użyciu Izoquick Nucleic Extraction Kit (Orca Research Inc., Bothell, Waszyngton, USA), zgodnie z instrukcją producenta, i wymieszane w 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). Ilość i czystość DNA oznaczano standardowymi metodami spektrofotometrycznymi. U niektórych osób DNA pobrano bezpośrednio z próbek krwi pełnej.

typowanie oparte na DNA z panelami sond oligonukleotydowych specyficznych dla sekwencji zostało wykorzystane do identyfikacji specyficznych alleli w loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 i dqb1. W przypadku DRB1, początkowy test o niskiej rozdzielczości wykrywa rodziny DRB1 od dbr1 * 01 do DRB1 * 14, po czym następuje 1 lub więcej testów o wysokiej rozdzielczości, które identyfikują specyficzne allele DRB1, jak opisano wcześniej (10, 11). Allele DQA1 i dqb1 oznaczono metodami podobnymi do opisanych wcześniej (9), z dodatkowymi sondami do wykrywania nowo zidentyfikowanych alleli (12). Antygeny klasy I HLA oznaczono za pomocą standardowego testu limfocytotoksyczności, który rozróżnia 20 antygenów HLA-a, 30 HLA-B i 8 antygenów HLA-Cw. Niektóre próbki poddano sekwencjonowaniu w celu określenia specyficznych alleli klasy i HLA (13). Aby potwierdzić przypisanie alleli HLA i antygenu oraz homozygotyczność, genotypowano wielu członków rodziny-w tym ojców i rodzeństwo badanych, jeśli są dostępne.

podkłady PCR specyficzne dla HLA. Sekwencje starterowe zostały zaprojektowane w oparciu o wszystkie znane sekwencje alleli (12). Synteza startera była wykonywana przez Oligos itp. (Wilsonville, Oregon, USA). Jeden Zestaw starterowy został zaprojektowany do kierowania polimorfizmem klasy i HLA i 3 ukierunkowanymi polimorfizmami klasy II HLA. Aby celować w HLA-B44, zaprojektowano starter, który wzmacnia grupę alleli HLA-B opartych na polimorfizmach w pozycjach 66, 69 i 75 eksonu 3 i inną grupę alleli HLA-B opartych na polimorfizmie w pozycji 229 eksonu 3. Połączenie starterów specyficznie wzmacnia allele HLA-B44, tworząc fragment o długości 190 bp. Wszystkie startery specyficzne dla DRB zostały zaprojektowane do wzmacniania grup alleli w oparciu o polimorfizmy sekwencji w nadmiennym regionie eksonu 2. Dla HLA-DRB5*01, jeden Starter wzmacnia grupę alleli DRB5*01 opartych na polimorfizmach w pozycjach 25, 26, 31, 32 i 38, a drugi wzmacnia grupę alleli DRB5*01 opartych na polimorfizmach między pozycjami 215 i 231. Połączenie starterów specyficznie wzmacnia allele HLA-DRB5*01, tworząc fragment 210 bp. Dla HLA-DRB1*04, jeden Starter wzmacnia grupę alleli DRB1*04 opartych na polimorfizmach w pozycjach 25, 26, 31 i 36, a drugi wzmacnia grupę alleli DRB1*04 opartych na polimorfizmach w pozycjach 97 i 110. Połączenie starterów specyficznie wzmacnia DRB1*04, tworząc fragment 104-bp. Dalsza dyskryminacja wśród alleli DRB1*04 została osiągnięta przez użycie poprzedniego startera wraz z 1 z 2 starterów, które dyskryminują dymorfizm w pozycji 258 (kodon 86), tworząc fragment 263-bp. Dla HLA-DRB1*11, jeden Starter wzmacnia grupę alleli DRB1*11 na podstawie polimorfizmów w pozycjach 25, 26, 28, 30, 31, 32, i 35 eksonu 2, a drugi Starter wzmacnia grupę alleli DRB1*11 opartych na polimorfizmach w pozycjach 173 i 174 eksonu 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. Reakcje PCR przeprowadzono w objętości 50 µL zawierającej 1,25–1,5 µg genomowego DNA, 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/l KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% wag./obj. żelatyny, 260 µmol/L każdego deoksynukleotydu, 0,5 U Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA), 2,5 U Amplitaq Gold DNA polimeraza (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) i 20 pmol każdego podkładu specyficznego dla HLA. Dodano ultraczystą wodę, aby uzupełnić końcową objętość 50 µL. Amplifikacja składała się z 5 minut w 96°C, 35 cykli w 95°C przez 35 sekund i w 65°C przez 35 sekund dla HLA-B44 (58,5°C dla DRB5*01; 72°C dla DRB1*04; 64,5°C dla DRB1*11), następnie 72°C przez 1 minutę, z końcowym etapem przedłużania w 72°C przez 10 minut. Optymalne wzmocnienie, czułość i swoistość uzyskano przez miareczkowanie MgCl2 i stężenia startera, liczbę termocykli i temperaturę wyżarzania. Wszystkie amplifikacje przeprowadzono w systemie GeneAmp 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Czułość testu określano za pomocą eksperymentów wzbogacających, w których docelowy DNA był seryjnie rozcieńczany i dodawany do stałej ilości DNA tła odpowiadającej allelom badanego. Testy PCR specyficzne dla HLA– B44 i DRB5*01 były w stanie wykryć co najmniej 1 komórkę docelową w tle 500 000 komórek; testy PCR specyficzne dla HLA-DRB1*04 I DRB1*11 były w stanie wykryć co najmniej 1 komórkę docelową w tle 100 000 komórek. Każdy test PCR obejmował następujące kontrole: a) pozytywną kontrolę DNA z linii komórkowej z interesującym allelem HLA (0,2-0,5 µg); (b) pozytywna Kontrola od matki testera (0,2–0,5 µg); (c) negatywna Kontrola DNA z linii komórkowej z tymi samymi allelami HLA co Tester (1,25 µg i 0,35 µg); oraz (d) negatywna Kontrola składająca się ze wszystkich odczynników PCR bez DNA. Produkty PCR były elektroforezowane pod stałym napięciem 100 V przez 1 godzinę w 6% lub 8% żelach prefabrykowanych TBE przy użyciu Mini-ogniwa Novex Xcell II (Novex, San Diego, Kalifornia, USA). Każdy żel zawierał dodatnie i ujemne kontrole PCR oraz drabinę 100 bp (SLL – 100; Gensura, Del Mar, Kalifornia, USA). Żele zostały poplamione srebrną plamą (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornia, USA) i suszone za pomocą DryEase Gel Drying System (Novex). DNA wyekstrahowane z pełnej krwi badano w 4 próbkach o niewystarczającej ilości do wyizolowania PBMC. Wszystkie testy przeprowadzono w dwóch egzemplarzach, a większość próbek zbadano więcej niż jeden raz.

Szczególną ostrożność zastosowano w celu uniknięcia i wykrycia ewentualnego zanieczyszczenia PCR. Osobne obszary zostały wykorzystane do separacji PBMC, ekstrakcji genomowego DNA, konfiguracji i amplifikacji PCR oraz analizy produktów PCR, z testami PCR przed i po przeprowadzonymi w oddzielnych laboratoriach. Końcówki do pipet odporne na aerozol (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Kalifornia, USA) zostały wykorzystane we wszystkich eksperymentach, a wiele kontroli negatywnych zostało uwzględnionych we wszystkich amplifikacjach PCR.

sekwencjonowanie produktów PCR specyficznych dla HLA. Siedem mikrolitrów pierwotnego produktu PCR specyficznego dla HLA poddano dodatkowym 40 cyklom wzmocnienia przy użyciu pierwotnych parametrów termocyklingu. Trzydzieści mikrolitrów tego produktu PCR poddano elektroforezie w 1,75% ultraczystym żelu agarozowym (GIBCO BRL, Grand Island, Nowy Jork, USA) i zabarwiono roztworem bromku etydyny (0,5 µg/mL). Taśmę wycięto, wymyto i oczyszczono za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick (QIAGEN Inc., Walencja, Kalifornia, USA). Oczyszczony produkt PCR eluowano do 30 µL 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0) i 100 ng dodano do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 8,0 µL odczynnika sekwencjonującego pre-mix (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol podkładu 5′ lub 3 ’ oraz 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Dodano ultraczystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 20 µL. Mieszaniny reakcyjne sekwencjonowania ogrzewano w temperaturze 96°C przez 3 minuty w termocyklerze GeneAmp System 9600, a następnie 25 cykli w temperaturze 96°C przez 10 sekund, 50°C przez 5 sekund i 60°C przez 4 minuty. Otrzymane produkty PCR oczyszczono w kolumnie i poddano elektroforezie, jak wyżej. Sekwencje zmysłowe i antysensowne oznaczono w dwóch egzemplarzach dla specyficznych dla HLA produktów PCR podmiotu i matki, jak również dla produktów PCR linii komórek kontroli pozytywnej. Analiza sekwencji została przeprowadzona przy użyciu pakietu Wisconsin w wersji 9.1 Oprogramowania firmy Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA).

przygotowanie szkieł Cytospin i hybrydyzacja in situ. Preparaty szkiełek Cytospin analizowano pod kątem obecności sekwencji specyficznych dla chromosomów X i Y, stosując technikę opracowaną w laboratorium cytogenetyki molekularnej Fred Hutchinson Cancer Research Center do ilościowej analizy chimeryzmu w parach przeszczepów komórek macierzystych niepasujących do płci (14). Próbki Cytospin męskich komórek przygotowano przez odwirowanie 30 000-60 000 świeżo oddzielonych PBMC na szkiełkach szklanych, 300 µL na szkiełko. Szkiełka były przechowywane w komorze osuszającej do czasu użycia. Sonda specyficzna dla chromosomu X DXZ1 (15) została przetłumaczona przez nick z digoksygeniną, a sonda specyficzna dla chromosomu Y DYZ1 (16) została przetłumaczona przez nick z biotyną. Mieszanina sondy XY miała końcowe stężenie 0,5 µg/mL każdej sondy w buforze hybrydyzacji 50% formamidu, 2× SSC (0,3 m chlorku sodu i 0,03 m cytrynianu sodu) i 10% siarczanu dekstranu. Był denaturowany w temperaturze 72°C przez 5 minut, chłodzony na lodzie i nakładany na szkiełko. Preparaty trawiono w pepsynie (0,1 mg/mL w 0.01 M HCl) w temperaturze 37°C przez 3 minuty, utrwalone w 4% buforowanej formalinie przez 15 minut, przepłukane w PBS, odwodnione w etanolu (70%, 95% i 100%) i wysuszone na powietrzu. Szkiełka poddano denaturacji w 2× SSC (72°C) przez 10 minut, 70% formamidu, 2× SSC (72 ° C) przez 3 minuty, odwodniono w serii etanolu (-20°C) i wysuszono na powietrzu. Na prowadnicę nałożono dziesięć mikrolitrów sondy, a następnie zamontowano ją pod osłoną (22 × 22 mm) uszczelnioną gumowym cementem. Inkubowano go przez noc w temperaturze 42°C w nawilżonej komorze. Szkiełka przemywano w 55% formamidem, 2× SSC (45°C) przez 15 minut i 2× SSC (temperatura pokojowa) przez 5 minut. Sygnały sondy były jednocześnie wykrywane z anty-digoksygeniną sprzężoną z fluoresceiną (rozcieńczenie 1:500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) i Awidyną sprzężoną z czerwienią Teksasu (rozcieńczenie 1: 500; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po myciu za pomocą 2 × SSC i PBS montowano je za pomocą Vectashield (Vector Laboratories). Szkiełka oceniano bezpośrednio przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego Nikon E600 z lampą rtęciową o mocy 100 W wyposażoną w odpowiednie filtry jedno -, dwu-i trzypasmowe. Wyliczano tylko komórki z dwoma widocznymi sygnałami chromosomowymi, bez użycia żadnego elektronicznego wzmocnienia.