wprowadzenie

atopowe zapalenie skóry (AD) jest powszechnym, nieuleczalnym, przewlekłym stanem zapalnym skóry z dużą częstością występowania u niemowląt, co powoduje znaczne obniżenie jakości życia.1-4 pomimo jego występowania i zachorowalności, obecnie istnieje kilka terapii celowanych dla AD. Podstawą postępowania jest złagodzenie objawów w oparciu o stosowanie niespecyficznych przeciwzapalnych miejscowych steroidów, inhibitorów kalcyneuryny i ogólnoustrojowych leków immunosupresyjnych, takich jak azatiopryna, cyklosporyna i prednizolon.4,5 te terapie są związane z niepożądanymi skutkami ubocznymi i istnieje duża niezaspokojona kliniczna potrzeba opracowania ukierunkowanych terapii AD, które są skuteczne, ekonomiczne i bezpieczne w użyciu, zwłaszcza u młodszych dzieci.5

przełomowy raport z 2006 r. 6 wykazał, że spośród wszystkich dotychczas zidentyfikowanych markerów mutacje utraty funkcji w genie profilaggryny białka bariery naskórkowej (FLG) wykazują najsilniejszy związek z AD.7,8 Profilaggryna, pierwotnie nazywana „białkiem bogatym w histydynę”ze względu na bardzo wysoką (~10%) zawartość histydyny,9 jest dużym (>400 kDa) polipeptydem syntetyzowanym w warstwie ziarnistej naskórka. Gromadzi się w granulkach keratohyaliny przed defosforylacją i przetwarzaniem, za pomocą półproduktów o niższej masie ,do ~ 37 kDa monomerów filaggryny.10,11 Filagryna agreguje cytokeratyny 1 i 10 oraz inne włókna pośrednie w ziarnistej warstwie keratynocytów, „zapadając” je w ramach procesu różnicowania końcowego naskórka, tworząc korneocyty i spłaszczone squames, które są krytyczne dla funkcji bariery skórnej.12,13 Filaggryna jest ostatecznie deiminowana i rozszczepiana przez proteazy, w tym kallikreinę 5, kaspazę-14, elastazę-2, matripazę i prostatynę, w jej składnik higroskopijne aminokwasy, które są głównym składnikiem „naturalnego czynnika nawilżającego” (NMF), który dodatkowo przyczynia się do funkcji barierowych poprzez nawilżenie skóry i utrzymanie kwasowości warstwy rogowej.14-16

pomimo genetycznego związku między mutacjami FLG I ad,które są najsilniejsze ze wszystkich markerów, 6 większość osobników AD jest typu dzikiego dla FLG.U tych osób efekty epigenetyczne związane z nasileniem choroby i środowiskiem cytokin zapalnych zmniejszają przetwarzanie filagryny i poziom NMF, pogarszając w ten sposób nawilżenie skóry i integralność bariery.Nieprawidłowa proteolityczna obróbka profilaggryny do funkcjonalnych monomerów filaggryny z powodu braku równowagi proteazy i przeciwproteazy może również odgrywać rolę w rozwoju choroby u pacjentów z FLG typu dzikiego.Zaburzona bariera skórna, czy to z powodu mutacji FLG, czy epigenetycznie upośledzonego przetwarzania profilaggryny, powoduje kserozę, wnikanie alergenów oraz inicjację i zaostrzenie choroby AD.21

znaczna część obecnej działalności badawczej ma na celu dalsze zrozumienie zaangażowania filaggryny w etiologię AD i przełożenie tych spostrzeżeń na nowe podejście terapeutyczne do tego przewlekłego i upośledzającego stanu.7,21 Otsuka i wsp.22 zbadali bibliotekę 1120 związków bioaktywnych i poinformowali, że jtc801, pochodna czterech aminochinoliny, miała zdolność do zwiększenia transkrypcji i translacji FLG w modelu równoważnym ludzkiej skórze. Metoda terapii genowej została wykorzystana do skutecznego dostarczenia monomeru kodującego filaggrynę do modelu myszy z niedoborem FLG (łuszczący się ogon), przywracając w ten sposób normalny fenotyp bariery skórnej.23

w tym artykule sugerujemy, że prostsza, odżywcza suplementacja l-histydyny może mieć korzystny potencjał w reklamie.

l-histydyna jest aminokwasem białkowym, który nie jest syntetyzowany przez ssaki. U niemowląt ludzi jest uważany za” niezbędny ” ze względu na niski poziom mikroflory jelitowej syntetyzującej histydynę i minimalną aktywność karnozynazy, która pomaga w uwalnianiu wolnej L-histydyny z karnozyny.24 nasze zainteresowanie użyciem L-histydyny w AD było stymulowane przez kilka obserwacji. Po pierwsze, zarówno u niemowląt, jak i dorosłych, dieta z niedoborem histydyny powoduje wysypkę wyprysk.U gryzoni 3H-histydyna jest szybko (1-2 godziny) włączana do profilaggryny w granulkach keratohyaliny po wstrzyknięciu dootrzewnowym lub śródskórnym14,26 i w ciągu 1-7 dni jest uwalniana jako wolny aminokwas NMF w górnej warstwie rogowej.Ponadto zmniejszone poziomy wolnych aminokwasów NMF w warstwie rogowej, w tym histydyny i jej zakwaszającego metabolitu kwasu urokanowego (UCA), są związane z nasileniem choroby AD i genotypem FLG.27,28

biorąc pod uwagę te dowody na zależność przetwarzania filaggryny i tworzenia NMF od odpowiednich poziomów L-histydyny, postawiliśmy hipotezę, że l-histydyna zarówno wzmocni przetwarzanie filaggryny w modelu in vitro, organotypowym, ludzkiej skóry i ma korzystne działanie jako suplement diety u osób z atopowym zapaleniem skóry.

metody

badania in vitro

stan hodowli ludzkich keratynocytów

uwiecznione ludzkie keratynocyty Hacat29 z fragmentów 35-41 (dar od Dr J. Wood, University Of Dundee; pochodzenie-niemieckie Centrum Badań nad Rakiem (DKFZ), Heidelberg, Niemcy) zostały zaszczepione w sześciostopniowych płytkach do hodowli komórkowych (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) w pożywce D-MEM/F-12 z Glutamaxem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną. Kultury jednowarstwowe Zwykle zbierały się po 48-72 godzinach. W dniach 15-21 pożywki do hodowli uzupełniano dodatkowymi 1-5 mM aminokwasami (l-lizyna, L-histydyna lub d-histydyna; Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). Komórki zbierano i lizowano buforem Laemmli (Sigma-Aldrich Co.) w dniu 21.

SDS-PAGE i Western-blotting

całkowite białko komórkowe z monowarstw HaCaT zostało rozdzielone przez 9% elektroforezę żelu poliakryloamidowego siarczanu dodecylu sodu (SDS-PAGE) i Western blotting przy użyciu standardowych protokołów. Zastosowano pierwotne przeciwciała przeciwko następującym antygenom: filaggrin (goat polyclonal niwecznik; Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) i keratin 10 (rabbit monoclonal; Abcam, Cambridge, UK). Analizę densytometryczną wykonano za pomocą VersaDoc Imaging System (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA); wszystkie zespoły zostały poprawione i znormalizowane do 10.

organic skin-equivalent models and Lucifer Yellow penetration assay

adult human dermal fibroblasts (HDFs; Thermo Fisher Scientific) z fragmentów 3-5 zmieszano z kolagenem ogonowym szczura i (Thermo Fisher Scientific) i pozostawiono do osadzenia w sześciostopniowych płytkach do hodowli komórkowych. Po 20-30 minutach Hakaty fragmentów 35-41 wysiewano na wierzchołkowej stronie żeli. Po osiągnięciu zbiegu komórek HaCaT całe Kultury (w tym struktury kolagenowe zawierające HDFs) zostały umieszczone na plastikowych siatkach, tworząc interfejs powietrze-ciecz z aspektem wierzchołkowym wystawionym na działanie powietrza. Kultury odpowiadające skórze utrzymywano łącznie przez 19 dni i uzupełniano w dniach 13-19 5 mM L-lizyny, l-seryny lub L-histydyny (Sigma-Aldrich Co.). Próbki przemywano dwukrotnie w PBS, utrwalano w formalinie, osadzano w parafinie i sekcjowano. Do barwienia hematoksyliną i eozyną stosowano standardowe protokoły. W dniu 19 modele skóry wykazywały keratynę 10, involukrynę, filagrynę i lorikrynę (dane nie zostały przedstawione), szczególnie w warstwach nadbasalnych, co wskazuje na różnicowanie podobne do naskórka.

dla testu penetracji, 50 µL 5 mM barwnika Dipotasowego Lucifer Yellow Ch (Sigma-Aldrich Co.) nanoszono na powierzchnię wierzchołkową każdego modelu skóry w środku w odstępach 5-minutowych przez łącznie 10 minut, przed zmyciem PBS, utrwalonym w formalinie i osadzonym w parafinie. Odparafinowane i uwodnione odcinki poprzeczne 3 µm wizualizowano za pomocą fluorescencji przy 455-495 / 505-555 nm. Lucifer Yellow jest rozpuszczalnym w wodzie fluorescencyjnym anionowym barwnikiem kwasu disulfonowego często stosowanym do badania morfologii neuronów. Wykorzystano go do oceny bariery przepuszczalności myszy i modeli równoważnych skórze.30-33

chociaż nasz model skóry nie wykazał dobrze ugruntowanej warstwy rogowej naskórka pod barwieniem hematoksyliny i eozyny, minimalną penetrację barwnika przez model skóry zaobserwowano w 5 minutach, co wskazuje na funkcjonalną barierę, równą ludzkiej naskórku. Przenikanie barwnika nie było zbiegające w całej próbce. W związku z tym średnią procentową penetrację barwnika obliczono w trzech następujących po sobie polach mikroskopowych (w sumie z każdego modelu skóry oceniono pięć sekcji).

kliniczne badanie pilotażowe suplementacji żywieniowej

pacjenci

Dorośli (>18 lat) pacjenci z rozpoznaniem AD zgodnie z „kryteriami diagnostycznymi atopowego zapalenia skóry U. K. Working Group 's Diagnostic Criteria for Atopic Dermatitis” 34 zostali zakwalifikowani. Kryteria wykluczenia obejmowały ciążę lub laktację, choroby wątroby, narażenie na naturalne lub sztuczne promieniowanie ultrafioletowe, immunosupresję spowodowaną chorobą lub lekami lub stosowanie chińskiej medycyny ziołowej w okresie 3 miesięcy poprzedzających badanie. Pacjenci mogli kontynuować stosowanie nieleczniczych środków zmiękczających i przerywaną terapię ratunkową miejscowych kremów steroidowych, które były rejestrowane w formularzach opisów przypadków podczas każdej wizyty.

projekt badania

było to randomizowane, podwójnie zaślepione, kontrolowane placebo, crossover, badanie pilotażowe suplementów diety, które badało działanie L-histydyny u dorosłych pacjentów z AD. Przedmioty były randomizowane za pomocą Randomizatora badawczego (www.randomizer.org) do grupy A lub grupy B. początkowe nasilenie choroby AD zostało ocenione przez przeszkoloną pielęgniarkę dermatologiczną przy użyciu zwalidowanego pomiaru punktowego atopowego zapalenia skóry (SCORAD).35 uczestnicy zostali również przeszkoleni do przeprowadzania pierwszej cotygodniowej samooceny nasilenia choroby AD przy użyciu zwalidowanego pomiaru wyprysku zorientowanego na pacjenta (POEM).Po 2-tygodniowym okresie wypłukiwania, w którym poproszono pacjentów, aby nie używali żadnego produktu leczniczego do leczenia AD, powtarzano te same środki, a pacjentom dostarczano identyczne saszetki zawierające 4 g L-histydyny (Grupa A) lub 4 g placebo (erytrytolu); Grupa B), które przyjmowano raz na dobę, rozpuszczając w porannym napoju owocowym. Pacjenci powrócili 4 i 8 tygodni później, a SCORAD była wykonywana przez jedną, przeszkoloną pielęgniarkę dermatologiczną podczas każdej wizyty. Pacjenci z grupy a następnie przeszli do placebo, a ci z grupy B przyjmowali l-histydynę przez następne 8 tygodni, a SCORAD był wykonywany przez przeszkoloną pielęgniarkę dermatologiczną w odstępach 4 tygodniowych, a kwestionariusze POEM były wypełniane w odstępach tygodniowych.

zatwierdzenie regulacji i etyki

brytyjska agencja regulacyjna ds. leków i produktów opieki zdrowotnej potwierdziła, że to pilotażowe badanie suplementacji żywieniowej dotyczące wpływu aminokwasu nie zostało sklasyfikowane jako „badanie kliniczne badanego produktu leczniczego”. Bolton Research Ethics Committee wydał zgodę na badanie (#08/H1009 / 52), które zostało przeprowadzone zgodnie z deklaracją z Helsinek 1964 i notą EMEA zawierającą wytyczne dotyczące dobrej praktyki klinicznej z pisemną, świadomą zgodą uzyskaną od wszystkich uczestników.

Statystyka

Analiza wariancji (jedno – lub dwukierunkowa, z wykonanymi odpowiednio testami post hoc Dunnetta i Bonferroni) oraz prosta analiza regresji liniowej zostały wykorzystane w badaniach in vitro. Zostały one wykonane przy użyciu GraphPad Prism w wersji 4.00 Dla Windows (GraphPad software, San Diego, CA, USA). Dane są pokazane jako wartości średnie ± odchylenie standardowe.

Analiza statystyczna pilotażowego badania klinicznego została przeprowadzona przez niezależnego analityka statystycznego (StatSol, Sereetz, Niemcy) przy użyciu SPSS w wersji 15. Dane przedstawiono jako średnie ± standardowe błędy, a znaczenie różnic między średnimi wyrażono jako dwustronną dokładną wartość P w testach sumy Rang Wilcoxona. Zarówno w badaniach klinicznych, jak i w badaniach in vitro wartości P <0,05 uznano za istotne.

wyniki

wpływ l-histydyny na przetwarzanie profilagryny i funkcje bariery skórnej in vitro

dodanie l-histydyny do monowarstwowych hodowli keratynocytów HaCaT (N=6) spowodowało zmniejszenie dużej ilości 120 kDa półproduktu profilaggryny 11 i jednoczesne zwiększenie 37 kDa monomerów filaggryny (ryc. 1). Ten wzrost w stosunku 37 kDa: 120 kDa (średnio 1,69, SD 0,46) był zależny od dawki l-histydyny (0-5 mM) (P<0,01), ale nie był obserwowany, gdy keratynocyty inkubowano z 5 mM d-histydyną (średnio 0,68, SD 0,13) lub l-lizyną (średnio 1,02, SD 0.37) (Rysunek 1).

Rysunek 1 L-histydyna zwiększa białko filagryny tworzenie się monowarstw keratynocytów u człowieka (hacat). A) reprezentatywne plamy Zachodnie wykazujące spadek 120 kDa filaggryny i wzrost 37 kDa tworzenia filaggryny po leczeniu L-histydyną. B) L-lizyna i D-histydyna nie miały istotnego wpływu na ekspresję białka filaggryny, podczas gdy L-histydyna zwiększyła stosunek filaggryny o 37 kDa do 120 kDa (P<0,01), w porównaniu z grupą kontrolną. (C) L-histydyna zwiększała stosunek 37 kDa: 120 kDa filagryny w sposób zależny od dawki (R2=0,54, p< 0,01). Paski błędów reprezentują średnią ± SD, gdzie n = 6. Wszystkie pasma zostały standaryzowane do kontroli obciążenia białka keratyny 10. **p< 0.01. skróty: OD, gęstość optyczna; WB, Western blot.

w celu zbadania wpływu L-histydyny na funkcję bariery naskórkowej, organotypowe Kultury równoważne skórze (Fig.barwnik fluorescencyjny (N=5, p<0,01) w porównaniu z grupą kontrolną (średnia 7,67, SD 0,37). To samo stężenie l-lizyny (średnia 8,78, SD 1,55) lub L-seryny (średnia 7,64, SD 2,00) nie miało wpływu na przenikanie barwnika (Fig.

Rysunek 2 L-histydyna wzmacnia funkcję bariery organotypowy model skóry, na co wskazuje penetracja fluorescencyjnego barwnika Lucifer Yellow. A) reprezentatywny obraz organotypowego modelu skóry z żółtym barwnikiem Lucyfera widzianym w Warunkach fluorescencji i barwieniem H&E. B) modele skóry wyhodowane w 5 mM L-histydynie miały zmniejszoną penetrację barwnika (N = 5; p<0,01), podczas gdy L-lizyna i L-seryna nie miały wpływu na funkcję barierową. Uwaga: **p < 0.01, n = 5. Skrót: H & e, hematoksylina i eozyna.

badanie pilotażowe klinicznej suplementacji żywieniowej

dane demograficzne i nasilenie objawów AD

dwadzieścia cztery osoby dorosłe z objawami AD poddano badaniu przesiewowemu i randomizowano do dwóch grup leczonych. Pacjenci z grupy A otrzymywali l-histydynę w okresie leczenia 1 z 8 tygodni, a następnie placebo w okresie leczenia 2, podczas gdy pacjenci z grupy B otrzymywali placebo, a następnie l-histydynę (rycina 3A). Trzech pacjentów (jeden w grupie A i dwóch w grupie B) zostało odrzuconych do badania po okresie wypłukiwania (rycina 3B). U pozostałych pacjentów włączonych do badania średni (standardowy błąd średniej ) wiek wynosił odpowiednio 25,9 (1,6) lat i 27,6 (1,6) lat w grupach a i B; 55% pacjentów w grupie A i 70% w grupie B stanowiły kobiety. Większość pacjentów była rasy kaukaskiej z jednym pacjentem rasy azjatyckiej i jednym z rasy azjatyckiej / kaukaskiej odpowiednio w grupach A I B.

Rysunek 3 protokół badania klinicznego i dane pacjenta. (A) schemat przedstawiający protokół badania, (B) pacjenci wypełniali kwestionariusze wiersza tygodniowo, oraz (C) dyspozycja pacjentów.Wykazano dobrą korelację między wynikami SCORAD i poem (R2=0,62) u pacjentów z grupy A (A) (N=11) i grupy B (A) (N=10) w tygodniu 0. Nie było różnicy w średniej punktacji SCORAD lub POEM pomiędzy obiema grupami (P = 0,86). skróty: Wiersz, wyprysk zorientowany na pacjenta; SCORAD, punktowanie atopowego zapalenia skóry; WO, okres wypłukiwania.

zarówno SCORAD z oceną kliniczną, jak i wiersz z oceną pacjenta były stosowane jako zwalidowane miary nasilenia choroby AD.35 w tygodniu 0 nie stwierdzono istotnej różnicy w średniej (SEM) SCORAD (31,9 i 28,3 ) i POEM (18,4 i 16,7 ) punktacji odpowiednio pomiędzy grupami A (N=11) i B (N=10). U wszystkich pacjentów stwierdzono silną korelację między wynikami SCORAD i Poem w tygodniu 0 (R2=0,62) (rycina 3C).

wpływ suplementacji żywieniowej l-histydyny na nasilenie AD

po suplementacji l-histydyny (okres 1), odnotowano znaczące zmniejszenie wyników w skali SCORAD w tygodniu 0 (34%, P= 0, 0029 i 32%, P=0, 0029; ryc. 4a) i POEM (39%, P=0, 0020 i 39%, P=0, 0010; ryc. 4B) w grupie A W 4 i 8 tygodniu, odpowiednio. Nie zaobserwowano istotnego zmniejszenia ciężkości choroby w grupie B, która otrzymywała placebo w okresie 1.W 4. lub 8. tygodniu (SCORAD: -16%, P= 0,3223 i 6%, P=0,5391; POEM: 2%, P=0,8438 i 16%, P=0,2695), odpowiednio (rycina 4a i B). W okresie 2. wykazano, że pacjenci z grupy B, którzy przeszli z placebo na l-histydynę, wykazywali poprawę w nasileniu choroby AD, chociaż efekt przeniesienia l-histydyny w grupie a w tym okresie uniemożliwiał sensowną analizę badania po przejściu z grupy A.

Rysunek 4 efekty suplementacji L-histydyny o nasileniu choroby ad. A) wyniki SCORAD i B) poem (średnia ± sem) były znacząco zmniejszone u pacjentów z grupy A (a) w 4.i 8. tygodniu (SCORAD, P=0,0029 i P=0,0029; poem, P=0,0020 i P=0,0010, odpowiednio) w 1. okresie, podczas gdy placebo nie miało wpływu na pacjentów z grupy B (a) w 1. okresie (SCORAD, p=0,3223 i P=0,5391; poem, P=0,0020 i P=0,0010). odpowiednio 0, 8438 i p = 0, 2695). W grupie A występuje wyraźny efekt „przeniesienia”L-histydyny między 8. a 12. tygodniem, co wyklucza sensowną analizę statystyczną w okresie 2. badania. skróty: AD, atopowe zapalenie skóry; wiersz, wyprysk zorientowany na pacjenta; SCORAD, Punktacja atopowego zapalenia skóry; sem, błąd standardowy średniej; WO, okres wypłukiwania.

działania niepożądane

potencjalne działania niepożądane były monitorowane i rejestrowane w trakcie badania. Nie stwierdzono działań niepożądanych bezpośrednio związanych z podawaniem l-histydyny lub placebo.

dyskusja

obecna terapia AD opiera się na paliatywnym stosowaniu emolientów i środków przeciwzapalnych, takich jak miejscowe kortykosteroidy lub inhibitory kalcyneuryny, z leczeniem nadkażenia, szczególnie z powodu Staphylococcus aureus i opryszczki pospolitej, gdy powstaje. Jeśli leczenie miejscowe nie powiedzie się, konieczne jest leczenie ogólnoustrojowe oparte na silnych lekach, takich jak kortykosteroidy, metotreksat, azatiopryna, cyklosporyna A lub mykofenolan mofetylu. Dobrze znane efekty długotrwałego stosowania kortykosteroidów ogólnoustrojowych obejmują osteoporozę, zaćmę, nadciśnienie i hiperglikemię. Leki immunosupresyjne, takie jak cyklosporyna A i azatiopryna, mają również poważne potencjalne działania niepożądane, w tym nieprawidłowości hematologiczne, predyspozycje do zagrażających życiu zakażeń, niewydolność wątroby i nerek, dlatego wymagają intensywnego monitorowania przez lekarza nadzorującego.5-36 biorąc pod uwagę wysoką częstość występowania AD (do 16% dzieci1 i 10% dorosłych2 na całym świecie), te niekorzystne skutki nakładają znaczne obciążenie na poszczególnych pacjentów i wysokie koszty finansowe dla systemów opieki zdrowotnej i społeczeństwa. Obecnie prowadzone są badania kliniczne ze środkami biologicznymi działającymi na elementy układu odpornościowego, ale jeśli są skuteczne, będą one kosztowne i prawdopodobnie będą ograniczone do najcięższej i opornej na leczenie AD. Obawy co do bezpieczeństwa tej klasy środków nadal, szczególnie w związku ze zwiększonym ryzykiem infekcji i nowotworów złośliwych.W związku z tym istnieje duża, niezaspokojona potrzeba kliniczna w zakresie bezpiecznych, wygodnych i ukierunkowanych niesteroidowych interwencji odpowiednich do długotrwałego stosowania w leczeniu AD, szczególnie u dzieci.

monowarstwy HaCaT wyhodowane w pożywkach wzbogaconych l-histydyną były związane ze znacznie zwiększoną ekspresją monomerów filaggryny o wartości 37 kDa w stosunku do półproduktu filaggryny o wartości 120 kDa. Nie zaobserwowano zwiększenia ekspresji monomerów filaggryny w pożywce wzbogaconej l-lizyną i D-histydyną, podobnymi strukturalnie, ale biologicznie nieaktywnymi izomerami l-histydyny. Mechanizm, dzięki któremu L-histydyna wzmocniła przetwarzanie filagryny w sposób specyficzny dla enancjomerów, jest niejasny, chociaż L-histydyna jest częstym uczestnikiem reakcji enzymatycznych37 ze względu na amfoteryczność łańcucha bocznego imidazolu.

monomery filaggryny 37 kDa są produktami pośrednimi proteolizy filaggryny, które są dalej rozkładane do mniejszych fragmentów peptydu filaggryny przez proteazy, w tym kalpainę-1 i kaspazę-14, a na koniec do wolnych aminokwasów przez hydrolazę bleomycyny.Oczekuje się, że zwiększone tworzenie monomerów filaggryny 37 kDa przez L-histydynę poprawi agregację keratyny i doprowadzi do zwiększenia poziomu wolnych składników aminokwasowych NMF. l-histydyna jest higroskopijna, a ta zdolność do przechwytywania i zatrzymywania wody sprawia, że jest ważnym składnikiem NMF.14 zdolność L-histydyny do zwiększenia przetwarzania filaggryny z konsekwentnym wzmocnieniem funkcji bariery skórnej jest wspierana przez nasze odkrycie, że odpowiedniki skóry uprawiane w pożywkach wzbogaconych l-histydyną były bardziej odporne na przenikanie przez Żółty barwnik fluorescencyjny Lucyfera. Obserwowany efekt może być spowodowany albo poprawą agregacji keratyny, albo zwiększonym poziomem NMF w modelach skóry z powodu zwiększonej dostępności substratu (tj. większej ilości monomerów filaggryny) do degradacji proteolitycznej, albo obu tych czynników. U osób z mutacjami FLG typu dzikiego lub heterozygotyczną utratą funkcji FLG, l-histydyna może poprawić objawy choroby poprzez zwiększenie tworzenia filaggryny i uzupełnienie produkcji NMF, podczas gdy u pacjentów z homozygotycznymi mutacjami FLG, l-histydyna może zwiększać ilość NMF w skórze. We wszystkich przypadkach oczekuje się, że wzmocnienie tworzenia filagryny i/lub uzupełniania NMF zwiększy funkcję bariery skórnej i zmniejszy obciążenie chorobą ad.

zastosowanie pierwszorzędowych ludzkich keratynocytów zamiast komórek HaCaT do badania funkcji barierowych można uznać za bardziej „fizjologiczne”. Jednak nasz wewnętrzny model równoważny skórze jest adaptacją techniki wykazanej przez Schoopa i wsp., 39, którzy wykazali, że komórki HaCaT, hodowane na styku powietrze–ciecz na różnych matrycach służących jako odpowiedniki skórne, mogą być używane do generowania wysoce zróżnicowanych organotypowych struktur równoważnych skórze in vitro. W przeciwieństwie do pierwotnych keratynocytów, które zwykle pochodzą z próbek ludzkiego napletka, linia komórkowa HaCaT ma standaryzowaną jakość, ponieważ jest niezależna od zmian dawców.

kliniczne badanie pilotażowe dotyczące suplementacji żywieniowej sugeruje, że doustna L-histydyna podawana raz na dobę przez okres 4 tygodni wiąże się z poprawą objawów przedmiotowych i podmiotowych u dorosłych pacjentów z AD. Zarówno w pomiarach nasilenia choroby ocenianych przez lekarza (SCORAD), jak i pacjenta (POEM), odnotowano ~40% spadek aktywności AD w ciągu 4 tygodni leczenia, co jest podobne do odnotowanego w przypadku stosowania kortykosteroidów o średniej mocy (Grupa III) do stosowania miejscowego.Korzystny wpływ obserwowany u pacjentów z grupy A utrzymywał się przez kilka tygodni po przejściu z l-histydyny na placebo, co sugeruje długotrwałą korzyść z leczenia l-histydyną. Co ważne, nie zgłoszono żadnych działań niepożądanych związanych z suplementacją L-histydyny.

wykazaliśmy in vitro zależny od stężenia L-histydyny wzrost tworzenia monomeru filaggryny o 37 kDa i związaną z l-histydyną poprawę funkcji barierowej modelu równoważnego skórze. Ta obserwacja koreluje z dowodami z klinicznego badania pilotażowego dotyczącego żywienia, że doustna L-histydyna może mieć korzyści terapeutyczne w AD. Chociaż istnieją ograniczenia dotyczące wielkości próby naszego badania pilotażowego, jeśli spójne, wyniki sugerują, że raz na dobę doustnie L-histydyna ma podobne skutki w AD do tych zgłoszonych dla średniej mocy (Grupa III) miejscowe kortykosteroidy.

obserwacje te, w połączeniu z ustalonym profilem bezpieczeństwa, sugerują, że suplementacja żywieniowa l-histydyny może być bezpieczną, wygodną, niesteroidową interwencją odpowiednią do długotrwałego stosowania w leczeniu AD, szczególnie u dzieci.

podziękowania

to badanie zostało wsparte grantami z Scottish Overseas Research Student Award, University of Edinburgh College Of Medicine and Veterinary Medicine PhD Scholarship oraz University of Manchester. CEMG jest starszym badaczem w Narodowym Instytucie Badań nad zdrowiem. Dziękujemy pielęgniarkom badawczym Centrum Dermatologii w Manchesterze za zarządzanie kliniczną częścią tego projektu, a także dziękujemy wszystkim wolontariuszom pacjentów za udział w tym badaniu.

wkład autora

wszyscy autorzy wnieśli wkład w analizę danych, opracowanie i krytyczną weryfikację artykułu, wyrazili ostateczną zgodę na publikację wersji i zgadzają się ponosić odpowiedzialność za wszystkie aspekty pracy.

ujawnienie

CEMG zgłasza dotacje od Zymogenetics, Stiefel i Regeneron, dotacje i opłaty osobiste od Novartis i Pfizer. NKG jest dyrektorem założycielem Curapel, firmy spin-out Uniwersytetu w Manchesterze posiadającej patenty w tej dziedzinie. Inni autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

		Williams H, Robertson C, Stewart A, et al. Ogólnoświatowe różnice w częstości występowania objawów wyprysku atopowego w międzynarodowym badaniu astmy i alergii w dzieciństwie. J Allergy Clin Immunol. 1999;103:125–138.
		Rönmark EP, Ekerljung L, Lötvall J, et al. Egzema wśród dorosłych: częstość występowania, czynniki ryzyka i związek z chorobami dróg oddechowych. Wyniki zakrojonego na szeroką skalę badania populacji w Szwecji. Br J Dermatol. 2012;166:1301–1308.
		Watson w, Kapur S. atopowe zapalenie skóry. Alergia Astma Clin Immunol. 2011; 7 (Suppl 1): S4.
		Weidinger S, Novak N. atopowe zapalenie skóry. Lancet. 2016;387:1109–1122.
		Katoh N. perspektywy na przyszłość w leczeniu atopowego zapalenia skóry. J Dermatol. 2009;36:367–376.
		Palmer CNA, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, et al. Typowe warianty utraty funkcji filagryny białka bariery naskórkowej są głównym czynnikiem predysponującym do atopowego zapalenia skóry. Nat Genet. 2006;38:441–446.
		Brown SJ, McLean WHI. Egzema genetyka: aktualny stan wiedzy i przyszłe cele. J Invest Dermatol. 129:543–552.
		Irvine AD, McLean WHI, Leung DYM. Mutacje filagryny związane z chorobami skóry i alergicznymi. N Engl J Med. 2011;365:1315–1327.
		Voorhees JJ, Chakrabarti SG, Bernstein IA. Metabolizm białka „bogatego w histydynę” w normalnej i łuszczycowej keratynizacji. J Invest Dermatol. 1968;51:344–354.
		Brown SJ, McLean WHI. Jedna niezwykła cząsteczka: filagryna. J Invest Dermatol. 2012;132:751–762.
		Robertson ED, Weir L, Romanowska m, Leigh IM, Pantelejew AA. ARNT kontroluje ekspresję genów różnicowania naskórka poprzez szlaki zależne od HDAC i EGFR. J Cell Sci. 2012;125:3320–3332.
		Lynley AM, Dale BA. The characterization of human epidermal filaggrin. A histidine-rich, keratin filament-aggregating protein. Biochim Biophys Acta. 1983;744:28–35.
		Gruber R, Elias PM, Crumrine D, et al. Filaggrin genotype in ichthyosis vulgaris predicts abnormalities in epidermal structure and function. Am J Pathol. 2011;178:2252–2263.
		Scott IR, Harding CR, Barrett JG. Histidine-rich protein of the keratohyalin granules. Źródło wolnych aminokwasów, kwasu urokanowego i kwasu pirolidonowego karboksylowego w warstwie rogowej. Biochim Biophys Acta. 1982;719:110–117.
		Hoste E, Kemperman P, Devos M, et al. Kaspaza-14 jest niezbędna do degradacji filagryny do naturalnych czynników nawilżających w skórze. J Invest Dermatol. 2011;131:2233–2341.
		Wielofunkcyjna rola filaggryny w alergicznych chorobach skóry. J Allergy Clin Immunol. 2013;131:280–291.
		Brown SJ, Relton CL, Liao h, et al. Filaggrin mutacje null i dzieciństwo atopowe egzema: populacja-based case-control study. J Allergy Clin Immunol. 2008;121:940–946.e3.
		Kezic S, O ’ Regan GM, Yau N, et al. Na poziom produktów degradacji filaggryny wpływa zarówno genotyp filaggryny, jak i nasilenie atopowego zapalenia skóry. Alergia. 2011;66:934–940.
		Modulacja cytokin atopowego zapalenia skóry filagrinowej ekspresji skóry. J Allergy Clin Immunol. 2009;124:R7–R12.
		Tan SP, Abdul-Ghaffar S, Weller RB, Brown SB. Protease-antiprotease imbalance may be linked to potential defects in profilaggrin proteolysis in atopic dermatitis. Br J Dermatol. 2012;166:1137–1140.
		Cabanillas B, Novak N. Atopic dermatitis and filaggrin. Curr Opin Immunol. 2016;42:1–8.
		Otsuka A, Doi H, Egawa G, et al. Możliwa nowa strategia terapeutyczna do regulacji atopowego zapalenia skóry poprzez regulację ekspresji filaggryny. J Allergy Clin Immunol. 2014;133:139–146.e1–10.
		Stout TE, McFarland T, Mitchell JC, Appukuttan B, Stout JT. Rekombinowana filagryna jest internalizowana i przetwarzana w celu skorygowania niedoboru filagryny. J Invest Dermatol. 2014;134:423–429.
		Bando K, Shimotsuji T, Toyoshima H, Hayashi C, Miyai K. Badanie fluorometryczne aktywności karnozynazy ludzkiej w surowicy u zdrowych dzieci, dorosłych i pacjentów z miopatią. Ann Clin Biochem. 1984;21 (Pt 6): 510-514.
		Kopple JD, Swendseid ME. Dowody na to, że histydyna jest niezbędnym aminokwasem u normalnego i przewlekle mocznicowego człowieka. J Clin Invest. 1975;55:881–891.
		Fukuyama K, Nakamura T, Benstein IA. Różnicowo zlokalizowane włączenie aminokwasów w stosunku do rogowacenia naskórka u noworodka szczura. Anat Rec. 1965;152:525–535.
		Tanaka M, Okada m, Zhen YX, et al. Obniżony stan nawilżenia warstwy rogowej i zmniejszona zawartość aminokwasów w powierzchni skóry u pacjentów z sezonowym alergicznym nieżytem nosa. Br J Dermatol. 1998;139:618–621.
		Kezic S, O ’ Regan GM, Yau N, et al. Na poziom produktów degradacji filaggryny wpływa zarówno genotyp filaggryny, jak i nasilenie atopowego zapalenia skóry. Alergia. 2011;66:934–940.
		Boukamp P, Petrussevska R, Breitkreutz D, Hornung J, Markham A, Fusenig N. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 1988;106:761–771.
		McMahon A, Butovich IA, Kedzierski W. Epidermal expression of an Elovl4 transgene rescues neonatal lethality of homozygous Stargardt disease-3 mice. J Lipid Res. 2011;52:1128–1138.
		Herrmann T, Gröne H-J, Langbein L, et al. Zaburzona struktura naskórka u myszy z przejściowo kontrolowanym niedoborem Fatp4. J Zainwestuj Dermatol. 2005;125:1228-1235.
		Jennemann R, Sandhoff R, Langbein L. i in. integralność i funkcja bariery naskórka są krytycznie zależne od syntezy glukozyloceramidu. J Biol Chem. 2007; 282: 3083-3094.
		EPP N., Furstenberger G., Muller K. i in. niedobór lipoksygenazy 12R zaburza funkcję bariery naskórka. J Biologia komórkowa. 2007;177:173-182.
		Williams HC, Burney PG, Pembroke AC, Hay RJ. Kryteria diagnostyczne atopowego zapalenia skóry przez brytyjską grupę roboczą. III. niezależna Walidacja szpitalna. Br J Dermatol. 1994;131:406–416.
		Schmitt J, Langan S, Williams HC. Jakie są najlepsze wyniki pomiarów dla wyprysku atopowego? Przegląd systematyczny. J Allergy Clin Immunol. 2007;120:1389–1398.
		Aktualizacja w leczeniu przewlekłej egzemy: nowe podejścia i pojawiające się możliwości leczenia. Clin Cosmetic Dermatol. 2010;3:99.
		Meth-Cohn O, Barton D, Nakanishi K. kompleksowa Chemia produktów naturalnych. London: Elsevier Science Ltd; 1999: 459.
		Kamata Y, Taniguchi a, Yamamoto m, et al. Neutralna proteaza cysteinowa hydrolaza bleomycyny jest niezbędna do rozpadu deiminowanej filagryny na aminokwasy. J Biol Chem. 2009;284:12829–12836.
		Schoop VM, Mirancea N, Fusenig NE. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 1999;112:343–353.
		Kirkup ME, Birchall NM, Weinberg EG, Helm K, Kennedy CTC. Acute and maintenance treatment of atopic dermatitis in children – two comparative studies with fluticasone propionate (0.05%) cream. J Dermatolog Treat. 2003;14:141–148.