2.1 oddychanie beztlenowe

podczas oddychania różne dehydrogenazy związane z błoną utleniają rozpuszczalne w wodzie substraty i redukują menachinon (MK) w błonie do menachinolu. W warunkach tlenowych elektrony są używane do redukcji tlenu do wody, podczas gdy w warunkach beztlenowych elektrony wzrostu układu oddechowego azotanu są przenoszone do azotanu, aby uzyskać azotyn (rys. 5.1). Jednym z głównych donorów elektronów oddychania jest NADH + H + wytwarzany w glikolizie i cyklu kwasu trikarboksylowego. Dwa typy dehydrogenaz nadh związanych z błoną, NDH-I i NDH-II, zostały opisane dla bakterii katalizujących utlenianie NADH + h+ do NAD + (Yagi, 1993). NDH-I składa się z 14 podjednostek, kodowanych przez nuo operon w Escherichia coli, i zawiera mononukleotyd flawiny (FMN) i kilka klastrów żelaza i siarki w celu połączenia transferu elektronów do pompowania protonu przez błonę. NDH-II składa się z pojedynczej podjednostki kodowanej przez gen ndh. NDH-II nie jest integralnym białkiem błonowym, ale związanym z wewnętrzną stroną błony cytoplazmatycznej. Zawiera dinukleotyd flawiny adeniny (FAD) jako grupę protetyczną, a transfer elektronów nie jest sprzężony z translokacją protonów. W genomie B. subtilis trzy geny, yjlD, yumB i yutJ, kodują potencjalne dehydrogenazy NADH typu NDH-II, podczas gdy nuo operon jest nieobecny w genomie B. subtilis (Kunst i wsp., 1997). YjlD, przemianowany na NDH, składa się z 392 reszt aminokwasowych i wykazuje 29% identyczności sekwencji z NDH-II E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Co ciekawe, ilość białka NDH B. w warunkach beztlenowych stwierdzono znaczne zmniejszenie subtilis (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh wydaje się być główną tlenową dehydrogenazą nadh B. subtilis, ponieważ mutacja genu ndh wykazywała defekt wzrostu tlenowego (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). W międzyczasie wykazano, że ekspresja Operonu yjlC-ndh jest regulowana przez regulator Rex, regulator transkrypcji z czujnikiem redoks, który reaguje na stosunek NADH / NAD+ (patrz również punkt 3.3) (Gyan i wsp., 2006). Natomiast ekspresję genu yumB stwierdzono w badaniach nad transkryptomem (E. Härtig, niepublikowane wyniki). Należy określić, czy YumB i YutJ mają aktywność dehydrogenazy NADH sugerowaną przez podobieństwo sekwencji białek i czy są one istotne w warunkach wzrostu układu oddechowego azotanów.

podobnie jak inne organizmy oddychające tlenowo, B. subtilis posiada dehydrogenazę bursztynianową (sdh), a dokładniej oksydoreduktazę bursztynianową:chinonową, SQR (Hägerhäll, 1997). Kompleks enzymatyczny jest integralną częścią błony cytoplazmatycznej u bakterii i wewnętrznej błony mitochondrialnej u eukariotów. Katalizuje utlenianie bursztynianu do fumaranu połączonego z redukcją chinonu. Tym samym enzym jest czynnościową częścią zarówno cyklu kwasu cytrynowego, jak i łańcucha oddechowego (Hägerhäll, Aasa, von Wachenfeldt, Hederstedt, 1992). SQR w B. subtilis zmniejsza MK i ma trzy podjednostki białkowe, SdhA, SdhB I SdhC. SdhA jest flawoproteiną z jedną kowalencyjnie związaną FAD, która prowadzi dwa utlenianie elektronowe bursztynianu do fumaranu w cytoplazmie. SdhB zawiera trzy klastry żelaza i siarki (,, i), które działają w przenoszeniu elektronów między grupą flawinową a hemem B cytochromu b558 w SdhC. SdhC ma pięć transmembranowych segmentów α-spiralnych i zakotwicza dimer SdhAB po cytoplazmatycznej stronie błony i działa w transmembranowym przenoszeniu elektronów do MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tołstoj, Aasa, & Hederstedt, 2000). Dwa kofaktory hemu b pośredniczą w przenoszeniu elektronów przez błonę cytoplazmatyczną na zewnętrzną stronę błony, w której zmniejsza się MK i zużywa dwa protony (Hederstedt, 2002). Różni się to od E. coli, gdzie protony do redukcji ubichinonu do ubichinolu są spożywane po negatywnej stronie błony, co nie wpływa na potencjał błony. B. subtilis i inne pałeczki, takie jak szczepy Bacillus megaterium i Bacillus cereus, mogą rosnąć w warunkach tlenowych z bursztynianem jako źródłem węgla i energii (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium I B. cereus nie rosną w warunkach beztlenowych w obecności glicerolu. Zgodnie z umową w genomach brakuje genów dla dehydrogenazy glicerolu-3. Jednak w B. subtilis wykryto Gen glpD dla tlenowego wariantu systemu transferu elektronów zlokalizowanego w błonie. Nie znaleziono homologii genów kodujących inne pierwotne dehydrogenazy obecne w E. coli, takie jak różne dehydrogenazy mrówczanowe, hydrogenazy, dehydrogenazy l-mleczanowe, dehydrogenazy d-aminokwasowe, jabłczany:oksydoreduktazy chinonowe lub dehydrogenazy glukozowe chinoprotein. Oczywiście, B. subtilis posiada tylko ograniczony zestaw pierwszorzędowych dehydrogenaz przekazujących elektrony, a mianowicie różne formy dehydrogenazy NDH-II i tlenowej dehydrogenazy glicerolu-3-fosforanowej.

w warunkach tlenowych elektrony są przekazywane z menachinolu przez kompleks cytochromu bc1 do oksydazy cytochromu c Typu AA3. W Warunkach mikroaerofilnych stosuje się oksydazę menachinolową typu cytochromu bd o wysokim powinowactwie tlenowym. Fumaran jako końcowy akceptor elektronów został wykluczony dla różnych prątków, w tym B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). W związku z tym geny reduktazy fumaranowej nie znajdują się w genomie B. subtilis. Inne szczepy Bacilli, takie jak Bacillus licheniformis i Bacillus circulans, mogą oddychać fumaranem, takim jak E. coli.

w Warunkach beztlenowego wzrostu B. subtilis przenosi elektrony wyłącznie do reduktazy azotanowej układu oddechowego. U bakterii klasyfikuje się trzy różne układy reduktaz azotanowych: cytoplazmatyczną asymilacyjną reduktazę azotanową zależną od nad(P)H (Nas), reduktazę azotanową związaną z błoną oddechową (Nar) i periplazmatyczną reduktazę azotanową odmienną (Nap). Wszystkie trzy należą do rodziny białek reduktazy DMSO i zawierają kofaktor dinukleotydu guaniny (MGD) bis-molybdopterin (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco,& Castillo, 1999). Genom B. subtilis koduje tylko reduktazę azotanową układu oddechowego Nar. Nar enzymy zazwyczaj składają się z trzech podjednostek. Duża podjednostka NarG zawiera miejsce aktywne z kofaktorem MGD, mniejsza rozpuszczalna podjednostka NarH zawiera jeden i trzy centra, a podjednostka NarI jest cytochromem B. Nar jest oksydazą chinolową, a Pula menachinolu jest utleniana przez podjednostkę Nari cytochromu B. Dwa elektrony przepływają przez Hem B NarI do klastrów żelazowo-siarkowych NarH i wreszcie do podjednostki cytoplazmatycznej NarG, która redukuje azotan do azotynów. Białko NarJ nie jest częścią enzymu, ale jest wymagane do końcowego montażu enzymu związanego z błoną (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). Ze względu na różne miejsca utleniania chinolu w periplazmie i redukcji azotanów w cytozolu, reduktaza azotanowa Nar przyczynia się do generowania gradientu protonowego (Fig. 5.1). Locus nar składa się z Operonu narGHJI (kodującego reduktazę azotanową układu oddechowego), narK (dla potencjalnego białka wytłaczania azotynów), otwartej ramki odczytu ywiC (o nieznanej funkcji), arfM kodującego modulator oddychania i fermentacji beztlenowej, a także genu regulatora beztlenowego Fnr (Cruz-Ramos i wsp., 1995; Kunst et al., 1997).

azotyn jest następnie dalej przekształcany w amoniak przez asymilacyjną reduktazę azotynową NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Asymilacyjna lub produkująca Amon reduktaza azotynowa zależna od NADH jest enzymem zawierającym siroheme, który katalizuje sześcioelektronową redukcję azotynów do amonu. Geny reduktazy azotynowej nasDE były częścią Operonu nasDEF i zostały znalezione bezpośrednio za OPERONEM nasBC, który koduje zależną od NADH reduktazę azotanową (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa i in., 1995).