wyniki

badaliśmy myszy typu dzikiego (WT), heterozygotyczne v2rv31r/WT i homozygotyczne v2r31r/V2R31R. Zmutowane myszy miały prawidłową liczbę i częstość występowania dojrzałych komórek T śledziony αβ i tymocytów na każdym etapie rozwoju. Ze względu na brak markerów kongennych, białka TCRß nie mogą być zidentyfikowane przez allel, który je koduje, ani czy zawierają regiony Cß1 w porównaniu z cß2. W ten sposób wykonaliśmy cytometrię przepływową z użyciem przeciwciał anty-V2 i anty-V31 do ilościowego oznaczania komórek wykazujących ekspresję białek TCRß V2+ i V31+. Zbadaliśmy tymocyty CD4+ i CD8+ single-dodatnie (SP), ponieważ są one Dojrzałymi i naiwnymi komórkami αβ T. Odzwierciedlając opublikowane dane (8, 9), wykryliśmy niewielką część (0,11%) komórek, które zabarwiły się obydwoma przeciwciałami u myszy WT (Fig. 1 B I C), co odpowiada niewielkiej populacji komórek T V2+V31+ αβ. Obserwowaliśmy 12,4-krotne zwiększenie frakcji tych komórek u myszy V2R31R/WT i 32,8-krotne zwiększenie u myszy v2r31r / v2r31r (Fig. 1 B I C). Te podwyższone częstotliwości komórek dual-tcrß+ odpowiadały większemu wykorzystaniu V2 i V31 w wyrażonych łańcuchach TCRß (Fig. 1 D-F). Dane te pokazują, że poprawa jakości RSS dwóch Vß na tym samym allelu zwiększa ich rearanżację, a w konsekwencji frakcję komórek T wyrażających dwa różne typy białek TCRß. Ponieważ repertuar vß tymocytów SP odzwierciedla względne poziomy rekombinacji poszczególnych segmentów Vß (10), preferencyjne zastosowanie V31 w stosunku do V2 ujawnia, że v31r odrzuca V2R do rearanżacji. Może to być spowodowane większą dostępnością V31 (11) lub interakcją V31 z segmentami Dß–Jß przed położeniem locus tcrß miejsca V2 w pobliżu segmentów dß–Jß. W szczególności, wyższy niż dwukrotny wzrost tych podwójnych komórek tcrß+ u myszy v2r31r/v2r31r w porównaniu z myszami v2r31r / WT oznacza, że dwa różne rearanżacje V (D)Jß mogą przyczynić się do ekspresji TCRß z tego samego allelu.

aby ustalić, czy pojedynczy allel TCRß może rzeczywiście wspierać ekspresję białek TCRß z dwóch różnych rearanżacji V(D)Jß, przeanalizowaliśmy myszy, gdzie jeden allel TCRß jest inaktywowany przez delecję wzmacniacza Tcrß (Eß) (12, 13). Zbadaliśmy myszy z allelem usuniętym przez Eß naprzeciwko allelu WT, allelu z zamiennikiem RSS V2 (V2R) lub V31 (V31R), lub obu (8). Wykryliśmy niewielki odsetek (0,094%) tymocytów V2+V31+ SP u myszy WT/EβΔ (Fig. 2 A i B), potencjalnie reprezentujące rzadką populację komórek wykazujących ekspresję dwóch różnych białek TCRß z tego samego allelu WT. Niezależnie od tego, obserwowaliśmy komórki V2+V31 + z 1,9-krotnie większą częstotliwością u myszy V2R / EβΔ i 4,8-krotnie większą częstotliwością u myszy v31r/EβΔ (Fig. 2 A i B). Tak więc, poprawa jakości albo Vß RSS podnosi frakcję komórek wyrażających zarówno białka V2+, jak i V31+ tcrß. W szczególności wykryliśmy 14,4-krotnie zwiększoną częstotliwość komórek V2+V31 + u myszy V2RV31R / EβΔ w stosunku do myszy WT / EβΔ (Fig. 2 A i B), co wskazuje, że poprawa jakości dwóch Vß rsss synergistycznie zwiększa procent komórek wyrażających zarówno białka V2+, jak i V31+ tcrß. Rzeczywiście, usunięcie części RSS V31 na allelu V2R (allel V2R31Δ; rys. 2C) radykalnie zmniejsza częstość występowania komórek V2+V31 + do poziomów równoważnych lub mniejszych niż u myszy V2R/EβΔ (0,178% w porównaniu z 0,135%; Fig. 2 A i B). Łącznie dane te potwierdzają, że allel V2R31R Promuje ekspresję dwóch różnych białek TCRß z dwóch różnych rearanżacji V(D)Jß na pojedynczym allelu.

nasze badania pokazują, że wewnętrzny mechanizm genetyczny reguluje monogenny montaż i ekspresję TCRß. Pokazujemy, że słabej jakości Vß rsss współpracują w celu ograniczenia montażu i ekspresji dwóch różnych genów TCRß z jednego allelu. Wcześniej wykazaliśmy, że słaba jakość Vß RSSs stochastycznie ogranicza częstotliwość rekombinacji Vß przed hamowaniem sprzężenia zwrotnego, aby zmniejszyć bialleliczny montaż i ekspresję genów TCRß (8). Teraz dalej wnioskujemy, że niskiej jakości RSS Vß również obniża częstość występowania rekombinacji V31 i vß na tym samym allelu. Te zmiany mogą obejmować albo 1) przesunięcie deletionalne V2 do klastra Dß1–Jß1–Cß1 i przesunięcie inwersjonalne V31 do klastra Dß2–Jß2–Cß2, albo 2) przesunięcie inwersjonalne V31 do klastra Dß1–Jß1–Cß1, które odwraca część locus zawierającą klaster Dß2–Jß2–Cß2, a następnie przesunięcie inwersjonalne V2 do klastra dß2–Jß2–Cß2.Gromada dß2-jß2-cß2 (7) (rys. 2D). Aby osiągnąć monogenny montaż i ekspresję TCRß, ten oparty na RSS mechanizm genetyczny może funkcjonować z procesami epigenetycznymi, które zostały zaangażowane w wymuszanie monoallelicznej rekombinacji Vß. Na przykład, zaproponowano, że dynamiczne interakcje segmentów Vß z laminą jądrową obniżają efektywność rekombinacji Vß poprzez tłumienie dostępności chromatyny Vß i zapętlanie chromosomów między klastrami Dß-Jß a segmentami vß (14, 15). W tym kontekście słaba jakość Vß RSSs może obniżyć prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch rearanżacji Vß na allelu, gdy zarówno V31, jak i segment vß w górę są dostępne, a segment vß w górę jest zapętlony w pobliżu segmentów Dß-Jß. Tak więc właściwości RSS mogą leżeć u podstaw monogennego montażu i ekspresji białek tcry, Tcrδ i Igλ u ssaków oraz białek Ig u ryb chrzęstnych. Dodatkowo, V RSS może podobnie przyczyniać się do wykluczenia izotypowego Igk i Igλ w komórkach B.