2. Opowieść o parabiozie

twierdzenie, że krew może odmłodzić nasze narządy, zostało zrewitalizowane przez jedną grupę badawczą w Stanford University School Of Medicine w 2005 i 2010 roku . Badania te wynikają z obserwacji, które pokazują, że zdolności regeneracyjne tkanek zmniejszają się wraz z wiekiem. W tkankach takich jak mięśnie, krew, wątroba i mózg spadek ten przypisuje się zmniejszonej reaktywności tkankowo specyficznych komórek macierzystych i progenitorowych . Jednak starsze mięśnie skutecznie regenerują się po szczepieniu w mięśnie u młodego gospodarza, ale Młode mięśnie wykazują upośledzoną regenerację po szczepieniu w starszym gospodarzu . Czynniki lokalne lub systemowe mogą być odpowiedzialne za te wzajemne skutki. W celu sprawdzenia, czy czynniki systemowe mogą wspomagać regenerację tkanek u młodych zwierząt i/lub hamować regenerację u starych zwierząt, w artykule Conboy i współpracownicy z 2005 r .opisano eksperymentalną konfigurację, w której – w przeciwieństwie do przeszczepiania – regenerujące się tkanki u starszych zwierząt są narażone tylko na czynniki krążące u młodych zwierząt i odwrotnie. W ten sposób ustalono parabiotyczne pary między młodymi i starymi myszami (parabiozy heterochroniczne), przy czym parabiotyczne pary między dwiema młodymi lub dwiema starymi myszami (parabiozy izochroniczne) służą jako kontrole (Fig. 1). W parabiozie dwie myszy są chirurgicznie połączone, tak że rozwijają wspólne krążenie krwi z szybką i ciągłą wymianą komórek i rozpuszczalnych czynników na poziomie fizjologicznym za pośrednictwem wspólnego układu krążenia . Parabioza została wynaleziona w 1864 roku przez fizjologa Paula Berta, aby sprawdzić, czy powstał wspólny układ krążenia. Clive McCay, biochemik i gerontolog z Cornell University w Ithaca, Nowy Jork, był pierwszym, który zastosował parabiozę do badania starzenia się, ale ta technika wypadła z łask po 1970 roku, prawdopodobnie dlatego, że wiele szczurów zmarło z powodu tajemniczej choroby zwanej chorobą parabiotyczną, która występuje około jednego do dwóch tygodni po połączeniu partnerów i może być formą odrzucenia tkanki. Dopiero na początku XXI wieku Irving Weissman i Thomas A. Rando na Uniwersytecie Stanforda przywrócili parabiozę do życia, badając ruch i losy komórek macierzystych krwi.

Parabioza. Dwie myszy są zszyte razem, dzieląc wspólny krwiobieg. Parabioza heterochroniczna występuje, gdy młoda mysz jest chirurgicznie połączona ze starszymi partnerami, podczas gdy parabioza izochroniczna odnosi się do par młodych-młodych lub starych zwierząt. Zmodyfikowano z ref. za zgodą Nature Publishing Group.

Grupa Stanford badała regenerację mięśni i proliferację komórek wątroby w Warunkach parabiozy. Po urazie mięśni, regenerację mięśni badano poprzez tworzenie miotub z ekspresją embrionalnego łańcucha ciężkiego miozyny, swoistego markera regeneracji miotub u dorosłych zwierząt. Pięć dni po urazie mięśnie u młodych zwierząt zarówno w parabiozach izochronicznych, jak i heterochronicznych silnie się regenerowały. Natomiast uszkodzone mięśnie starych parabiontów izochronicznych słabo się regenerowały. Warto zauważyć, że parabioza u młodych myszy znacznie zwiększyła regenerację mięśni u starych partnerów. Regeneracja starzejących się mięśni była prawie wyłącznie wynikiem aktywacji rezydentnych, starzejących się komórek progenitorowych, a nie wszczepienia krążących komórek progenitorowych od młodych partnerów (oceniana na podstawie obecności mniej niż 0,1% komórek ekspresyjnych Zielonego fluorescencyjnego białka pochodzących od młodych partnerów transgenicznych dla GFP). Ponieważ utrata regeneracji mięśni wraz z wiekiem jest częściowo spowodowana zaburzeniami związanymi z wiekiem w regulacji up ligandu Delty po urazie mięśni, badano również ekspresję Delta. Warto zauważyć, że komórki satelitarne starszych partnerów heterochronicznych parabiontów wykazały wyraźną regulację Delta, porównywalną do tej występującej u ich młodych partnerów i u młodych myszy nie poddanych parabiotycznym parom (Fig. 2).

starzenie się mięśni, wątroby i mózgu u starych myszy i odmłodzenie przez parabiozę heterochroniczną. Regeneracja mięśni szkieletowych po urazie jest związana z regulacją delty ligandu w górę, która jest tracona wraz z wiekiem (górne panele). Proliferacja hepatocytów u młodych zwierząt koreluje ze zmniejszeniem kompleksu cEBP-α-brahma (cEBP-α-Brm) w porównaniu do starszych myszy (środkowe panele). Podczas gdy młode zwierzęta mogą zwiększyć swoją neurogenezę i angiogenezę w strefie podkomorowej mózgu, gdzie obecne są nerwowe komórki macierzyste, starsze zwierzęta nie mogą (dolne panele). W zasadzie parabioza heterochoniczna przywraca wszystkie fenotypowe i molekularne cechy starzenia się poprzez przenoszenie rozpuszczalnych czynników i komórek.

w przypadku badań wątroby i mięśni, podczas gdy proliferacja komórek albuminowych u starych parabiontów izochronicznych była mniejsza niż obserwowana u młodych parabiontów izochronicznych, parabioza u młodego partnera znacząco zwiększyła proliferację hepatocytów u starszych myszy. Podobnie jak w mięśniach, zwiększenie proliferacji hepatocytów u starszych myszy było spowodowane komórkami rezydującymi, a nie wszczepieniem krążących komórek od młodych partnerów. Spadek proliferacji komórek progenitorowych hepatocytów jest spowodowany powstaniem kompleksu z udziałem cEBP-α i chromatyny remodeling factor brahma (Brm), który hamuje ekspresję genu napędzanego przez E2F . Równolegle z wpływem na regenerację hepatocytów wykryto powstawanie kompleksu cEBP-α-Brm w wątrobie starych parabiontów heterochronicznych, ale nie młodych parabiontów izochronicznych, a kompleks zmniejszono u starych parabiontów heterochronicznych (Fig. 2). Wreszcie, w mięśniach i wątrobie, zauważyli zmniejszenie proliferacji komórek progenitorowych u młodych myszy po parabiotycznym parowaniu ze starymi myszami, co sugeruje, że stare myszy są wzbogacone o czynniki hamujące, które są rozcieńczane po parabiozie. Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że istnieją czynniki ogólnoustrojowe, które mogą modulować molekularne szlaki sygnałowe o krytycznym znaczeniu dla aktywacji lub hamowania tkankowo-specyficznych komórek progenitorowych, oraz że środowisko systemowe młodego zwierzęcia jest środowiskiem sprzyjającym pomyślnej regeneracji, podczas gdy środowisko starszego zwierzęcia albo nie promuje, albo aktywnie hamuje pomyślną regenerację tkanek. Wreszcie, praca ta wykazała również, że specyficzne dla tkanek komórki macierzyste / progenitorowe zachowują znaczną część swojego wewnętrznego potencjału proliferacyjnego, nawet gdy są stare, ale związane z wiekiem zmiany w środowisku systemowym i / lub niszy, w której znajdują się komórki progenitorowe, uniemożliwiają pełną aktywację tych komórek do produktywnej regeneracji tkanek.

w pracy z 2010 roku, Wagers i współpracownicy próbowali dowiedzieć się, jaka jest rola lokalnych mikrośrodowiskowych niszowych i ogólnoustrojowych czynników w starzeniu się hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (Hspc), wykorzystując parabiotyczny system myszy in vivo i badając częstość HSC i liczbę długoterminowych HSC (LT-HSC). Markery kongeniczne zostały użyte do odróżnienia HSCs od starszych i młodych partnerów. Starzeniu się na poziomie szpiku kostnego towarzyszy znaczna ekspansja Hspc połączona paradoksalnie ze zmniejszoną zdolnością do odtwarzania krwi i przekrzywionym potencjałem różnicowania po przeszczepie . Starsze parabionty heterochroniczne wykazywały znaczne zmniejszenie LT-HSC, które zbliżało się do normalnego poziomu „młodzieńczego”. W szczególności efekt ten wynikał ze zmian w samej populacji osób w podeszłym wieku, a nie z przemytu „młodych” komórek do szpiku starszych partnerów. Co więcej, parabioza heterochroniczna indukowała również odzyskiwanie funkcji LT-HSC u starszych myszy, o czym świadczy potencjał wszczepienia i przywrócenie młodzieńczych proporcji limfoidów B do komórek mieloidalnych. Podobnie jak w przypadku HSCs, zarówno częstość, jak i całkowita liczba osteoblastycznych komórek niszowych izolowanych od starszych myszy były zwiększone w porównaniu z młodymi grupami kontrolnymi. Eksperymenty in vitro interakcji pomiędzy młodymi komórkami szpiku kostnego ze starymi osteoblastycznymi komórkami niszowymi, wykazujące również ekspansję HSC, sugerowały, że odmładzające działanie HSC parabiozy heterochronicznej występuje pośrednio – poprzez odwrócenie związanych z wiekiem zmian w osteoblastycznych komórkach niszowych. Rzeczywiście, częstość i liczba osteoblastów zostały przywrócone do poziomu młodzieńczego, gdy starsze zwierzęta doświadczyły parabiozy heterochonicznej w młodym środowisku ogólnoustrojowym. Co więcej, komórki niszowe wyizolowane z parabiozy starzejącej się heterochronicznej wykazały znacznie zmniejszoną zdolność do powodowania gromadzenia się HSPC, w przeciwieństwie do komórek niszowych z parabiozy starzejącej się izochronicznej. Co ciekawe, komórki niszowe osteoblastów wyizolowane z młodych parabiontów heterochronicznych wywołały nieznaczną ekspansję młodych Parabiontów heterochronicznych w porównaniu do młodych parabiontów izochronicznych. Te badania in vitro sugerowały wzajemny wpływ starzejącego się środowiska krążenia na aktywność niszową u młodych partnerów heterochronicznych i wskazują, że sygnały systemowe przywracają starzejące się nisze. Przeprowadzono dalsze eksperymenty mające na celu ocenę zdolności młodych Hspc do odtworzenia hematopoezy. Wyniki wykazały, że podobnie jak zaburzona funkcja wszczepienia naturalnie starzonych komórek HSCs , Młode Hspc wystawione in vitro na starzone izochroniczne komórki niched wykazywały zmniejszoną zdolność do odtwarzania krwiotwórczego. Oznacza to, że interakcja ze starymi osteoblastycznymi komórkami niszowymi jest wystarczająca do wywołania wad funkcji HSC. Starzejące się heterochroniczne komórki niszowe nie zmieniały jednak aktywności odtwarzającej młodych HSCs. Łącznie dane te wykazały, że indukowane wiekiem, funkcjonalne zmiany w komórkach niszy REGULATOROWEJ HSC mogą być odwrócone przez młode czynniki krążące. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują ponadto, że odmładzający wpływ młodego krążenia na HSC jest przekazywany pośrednio – poprzez sygnalizację z odmłodzonych osteoblastycznych komórek niszowych.

aby zrozumieć, który czynnik jest zaangażowany w regulację funkcji komórek niszowych, autorzy starali się zbadać, czy insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1) może odgrywać rolę. Wykazano, że IGF-1 jest ewolucyjnie konserwowanym regulatorem starzenia i długowieczności . Eksperymenty in vitro i in vivo wykazały, że miejscowe, a nie ogólnoustrojowe, IGF-1 wydaje się indukować starzenie się niszowych komórek regulatorowych HSC i że neutralizacja sygnalizacji IGF-1 w mikrośrodowisku szpiku kostnego odwraca związane z wiekiem zmiany w osteoblastycznych komórkach niszowych, które upośledzają ich odpowiednią regulację HSCs.

ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że podczas gdy w młodzieńczych warunkach osteoblastyczne komórki niszowe promują homeostatyczne utrzymanie komórek macierzystych, są one zmieniane przez starzenie się tak, że zamiast tego pozwalają na zwiększoną akumulację dysfunkcyjnych HSCs. Te specyficzne dla wieku zmiany w komórkach niszowych wydają się być sygnalizowane przez nietypowe czynniki krążące, które działają częściowo przez zmianę sygnalizacji IGF-1 w samej komórce niszowej (Fig. 3). Jest prawdopodobne, że IGF-1 nie odgrywa głównej roli dla wszystkich starzejących się tkanek, ponieważ podczas gdy jego rola w niszy osteoblastycznej Promuje wiek, w przeciwieństwie do lokalnej ekspresji mięśni szkieletowych IGF-1 utrzymuje zdolność regeneracyjną u starszych zwierząt.

w październiku 2010 trzech z czterech autorów, w tym Amy J. Wagers, wycofał ten artykuł, w szczególności za rolę osteoblastycznych komórek niszowych w odmładzaniu HSCs u starszych myszy . Stwierdzono, że pierwszy autor manipulował obrazami guzków kostnych utworzonych w osteoblastycznych komórkach niszowych u młodych i starszych myszy (Retraction Watch, http://retractionwatch.com/2012/08/29/ori-finds-harvard-stem-cell-lab-post-doc-mayack-manipulated-images/). W ten sposób należy uzyskać dalsze potwierdzenie jego problemu, biorąc pod uwagę również fakt, że model parabiozy został wykorzystany do badania odmładzania innych starych narządów. W rzeczywistości pojawiły się dwa dokumenty pokazujące, że wystawienie młodej myszy na Stare środowisko systemowe może hamować miogenezę i neurogenezę .

w 2013 roku zespół kierowany przez Amy J. Wagers opublikował kolejną pracę, w której zademonstrowali przy użyciu modelu parabiozy, że związany z wiekiem przerost serca może zostać odwrócony przez ekspozycję na Młode środowisko krążenia z zaledwie 4 tygodniową parabiozą . Pomiary ciśnienia tętniczego krwi oraz stężenia angiotensyny II i aldosteronu w różnych grupach krwi wykazały wyraźnie, że odwrócenia przerostu mięśnia sercowego u starych myszy narażonych na Młode krążenie nie można wyjaśnić prostym obniżeniem ciśnienia krwi lub modulacją znanych czynników wpływających na ciśnienie krwi u starszych myszy. Co ciekawe, parabioza heterochroniczna nie powodowała zmian w stosunku masy serca do piszczeli, wielkości kardiomiocytów ani ciśnienia krwi u młodych myszy przyłączonych do starszych partnerów. Dane te wiązały się z czynnikiem przeciwhipertroficznym wytwarzanym przez młode myszy (zamiast rozcieńczania czynnika prohypertroficznego wytwarzanego przez stare myszy) w przebudowie serca wywołanej parabiozą heterochroniczną. W „pozorowanej parabiozie”, w której myszy są chirurgicznie łączone, pozostawiając skórę nienaruszoną, tak że nie rozwijają wspólnego krążenia, nie stwierdzono znaczącej różnicy w stosunku masy serca do długości piszczeli u starszych myszy, co dodatkowo wskazuje, że krążenie krzyżowe i wymiana czynników krwiopochodnych są wymagane do odwrócenia związanego z wiekiem przerostu serca. Aby zidentyfikować te czynniki, szeroko zakrojona analiza proteomiczna z wykorzystaniem technologii opartej na aptamerze ujawniła 13 analitów, które niezawodnie odróżniały młode myszy od starych myszy. Jeden z tych kandydatów, czynnik różnicowania wzrostu 11 (GDF11), członek nadrodziny activin/TGF-β, został potwierdzony w dalszych analizach. GDF11 został zmniejszony w osoczu starych izochronicznych w porównaniu do młodych myszy izochronicznych i został przywrócony do młodzieńczego poziomu u starych myszy po ekspozycji na Młode krążenie. Codzienne 30-dniowe leczenie starych myszy GDF11 doprowadziło do znacznego zmniejszenia stosunku masy serca do długości kości piszczelowej w porównaniu do grupy kontrolnej wstrzykniętej solą fizjologiczną. Dane te sugerują, że co najmniej jeden patologiczny Składnik związanej z wiekiem rozkurczowej niewydolności serca ma charakter hormonalny. Jednakże obserwowana regresja przerostu serca u starych myszy narażonych na Młode krążenie jest mało prawdopodobne, aby można ją było przypisać całkowicie uzupełnieniu jednego czynnika i inne czynniki powinny być rozpoznawane.

dwa kolejne badania przeprowadzone przez Wagers i współpracowników wykazały, że GDF11 przyspieszył wzrost nowych naczyń krwionośnych i neuronów w mózgu i pobudził komórki macierzyste do regeneracji mięśni szkieletowych w miejscach urazów . W jednej z tych prac model heterochronicznej parabiozy myszy ujawnił wzrost objętości naczyń krwionośnych mózgu i przepływu krwi w odpowiedzi na Młode czynniki systemowe , wraz z wyższym samoodnawianiem i różnicowaniem w populacji komórek macierzystych strefy podkomorowej, przynosząc poprawę dyskryminacji węchowej (Fig. 2). Ponadto odkryli, że GDF11 może zwiększać objętość naczyń krwionośnych, a także neurogenezę u starych myszy. Co ciekawe, krew 15-miesięcznych myszy nie zmniejszyła populacji neuronowych komórek macierzystych w młodym mózgu, podczas gdy starsza krew (21 miesięcy) wywołała szkodliwy efekt, sugerując, że starsze zwierzęta wyższe nagromadzenie szkodliwych czynników systemowych i/lub niższe czynniki ochronne młodych. Z drugiej strony, w artykule autorstwa Rando i Tony 'ego Wyss-Corey’ a jako starszych naukowców, CHEMOKINA CCL11/eotaxin została zidentyfikowana jako czynnik krwi związany z wiekiem związany ze zmniejszoną neurogenezą i zaburzeniami uczenia się i pamięci u myszy . Należy określić, czy CCL11 oddziałuje bezpośrednio z neuronowymi komórkami progenitorowymi podczas starzenia, wpływając na ich zdolność różnicowania, lub ma działanie pośrednie poprzez interakcje z innymi neurogennymi niszowymi typami komórek.

w innym artykule Wagersa i współpracowników wykazano , że komórki satelitarne sortowane od starszych myszy heterochronicznych poprawiły zdolność różnicowania miogennego, a także zmniejszyły uszkodzenia DNA w porównaniu z komórkami satelitarnymi od starszych izochronicznych kontroli. Jeśli chodzi o odwrócenie przerostu serca związanego z wiekiem, leczenie starszych myszy codziennymi wstrzyknięciami dootrzewnowymi rekombinowanego GDF11 przez 4 tygodnie zwiększyło liczbę komórek satelitarnych z nienaruszonym DNA w porównaniu z komórkami starszych myszy otrzymujących sam nośnik. Ponadto, w modelu urazu mięśni, leczenie gdf11 starszych myszy 28 dni przed urazem i kontynuowane przez 7 dni później przywróciło więcej młodzieńczych profili kalibru mięśniówki w regeneracji mięśni. Starsze myszy leczone GDF11 wykazały również zwiększoną średnią wytrzymałość wysiłkową i siłę chwytu.

w tym ostatnim artykule odkryli również, że in vitro ekspozycja starszych komórek satelitarnych na GDF11, ale nie miostatynę (inny członek nadrodziny TGF-β) lub TGF-β1, powodowała reagujący na dawki wzrost proliferacji i różnicowania komórek satelitarnych, co sugeruje, że GDF11, w przeciwieństwie do miostatyny, może działać bezpośrednio na komórki satelitarne, aby zmienić ich funkcję.