Aktywacja RNazy h

RNase H jest wszechobecnym enzymem degradującym nić RNA dupleksu RNA–DNA. Został zidentyfikowany w organizmach tak różnorodnych jak wirusy i komórki ludzkie (Crouch and Dirksen, 1985). W komórkach eukariotycznych zidentyfikowano co najmniej dwie klasy RNazy H. U prokariotów zaobserwowano wiele enzymów o aktywności RNazy H (Crouch i Dirksen, 1985). Chociaż Rnaza H bierze udział w replikacji DNA, może odgrywać inne role w komórce i znajduje się w cytoplazmie ,a także w jądrze (Crum et al., 1988). Uważa się jednak, że stężenie enzymu w jądrze jest większe, a niektóre enzymy występujące w preparatach cytoplazmatycznych mogą być spowodowane wyciekiem jądrowym.

dokładne elementy rozpoznawania RNase H nie są znane. Wykazano jednak, że oligonukleotydy o właściwościach podobnych do dna, tak krótkie, jak tetramery, mogą aktywować Rnazę H (donis-Keller, 1979). Zmiany w aktywacji RNazy H wpływającej na cukier jako modyfikacje cukrowe, w wyniku których powstają oligonukleotydy podobne do RNA, np. 2′-fluoro lub 2′-metoksy, nie wydają się służyć jako substraty dla RNazy H (Sproat i in., 1989; Kawasaki et al., 1993). Zmiany w orientacji cukru na zasadę mogą również wpływać na aktywację RNazy H, ponieważ α-oligonukleotydy nie są w stanie indukować RNazy H lub mogą wymagać równoległego wyżarzania (Gagnor i in., 1989; Morvan et al., 1991). Dodatkowo, modyfikacje szkieletowe wpływają na zdolność oligonukleotydów do aktywacji RNazy H. Metylofosfoniany nie aktywują RNazy H (Maher i wsp ., 1989; Miller, 1989). Natomiast fosforotioiniany są doskonałymi substratami (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein and Cheng, 1993). Ponadto, cząsteczki chimeryczne badano jako oligonukleotydy, które wiążą się z RNA i aktywują Rnazę H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Na przykład oligonukleotydy złożone ze skrzydeł 2 ’ – metoksyfosfonianów i pięcio-zasadowej szczeliny deoksyoligonukleotydów wiążą się z docelowym RNA i aktywują Rnazę H(Furdon i wsp ., 1989; Quartin et al., 1989). Ponadto wykazano, że pojedynczy rybonukleotyd w sekwencji deoksyrybonukleotydów jest wystarczający, aby służyć jako substrat dla RNazy H, gdy jest związany z komplementarnym deoksy-oligonukleotydem (Eder I Walder, 1991).

Wykazano również, że możliwe jest wykorzystanie chimerycznych oligonukleotydów zaprojektowanych do aktywacji RNazy H i mają większe powinowactwo do receptorów RNA oraz do zwiększenia swoistości (Giles and Tidd, 1992; Monia et al., 1993). W jednym z badań, rozszczepianie transkryptu docelowego za pośrednictwem RNazy H było znacznie bardziej selektywne, gdy deoksyoligonukleotydy złożone ze skrzydeł deoksyoligonukleotydowych metylofosfonianów i szczelin fosfodiestrowych porównywano z pełnymi oligonukleotydami fosfodiestrowymi (Giles and Tidd, 1992).

pomimo informacji o Rnazie H i wykazania, że wiele oligonukleotydów może aktywować Rnazę h w testach lizatu i oczyszczonego enzymu, stosunkowo niewiele wiadomo na temat roli cech strukturalnych w celach RNA w aktywacji RNazy h (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder and Walder, 1988). W rzeczywistości do niedawna brakowało bezpośredniego dowodu na to, że aktywacja RNazy H jest mechanizmem działania oligonukleotydów w komórkach.

ostatnie badania w naszych laboratoriach dostarczają dodatkowych, choć pośrednich, wglądu w te pytania. ISIS 1939 jest 20-metrowym fosforotionianem komplementarnym do sekwencji w 3 ’ – nieprzetłumaczonym regionie ICAM-1 RNA (Chiang i in., 1991). Hamuje wytwarzanie ICAM w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej człowieka, a Północne plamy wykazują, że mRNA ICAM-1 ulega szybkiej degradacji. Analog 2 ’ – metoksy ISIS 1939 wykazuje większe powinowactwo do RNA niż fosforotionian, jest stabilny w komórkach, ale hamuje produkcję białka ICAM-1 znacznie mniej silnie niż ISIS 1939. Jest prawdopodobne, że ISIS 1939 destabilizuje RNA i aktywuje Rnazę H. w przeciwieństwie do ISIS 1570, 18-merowy fosforotionian, który jest komplementarny do kodonu inicjacji translacji wiadomości ICAM-1, hamował produkcję białka, ale nie powodował degradacji RNA. Tak więc dwa oligonukleotydy, które są zdolne do aktywacji RNazy H, miały różne efekty w zależności od miejsca w mRNA, w którym się wiązały(Chiang i in., 1991). Bardziej bezpośredni dowód na to, że Rnaza H jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem w aktywności wielu antysensownych oligonukleotydów, przedstawiono w badaniach, w których zastosowano odwrotną ligację PCR do identyfikacji produktów rozszczepiania z mRNA bcrablu w komórkach leczonych oligonukleotydami fosforotionianowymi (Crooke i in., 1995).

biorąc pod uwagę pojawiającą się rolę chimerycznych oligonukleotydów z modyfikacjami w skrzydłach 3′- i 5′-zaprojektowanych w celu zwiększenia powinowactwa do docelowej stabilności RNA i nukleazy oraz luki typu DNA służącej jako substrat dla RNazy H, badania skupione na zrozumieniu wpływu różnych modyfikacji na wydajność enzymu (- ów) mają również duże znaczenie. W jednym z takich badań nad Rnazą H E. coli zgłosiliśmy, że enzym wykazuje minimalną swoistość sekwencji i jest procesywny. Gdy chimeryczny oligonukleotyd z cukrami modyfikowanymi 2′ w skrzydłach hybrydyzowano z RNA, początkowym miejscem rozszczepiania był nukleotyd przylegający do złącza metoksy – deoksy najbliżej 3′-końca substratu RNA. Początkowa szybkość rozszczepiania zwiększała się wraz ze wzrostem rozmiaru szczeliny DNA, a skuteczność enzymu była znacznie mniejsza w stosunku do celu RNA dupleksowanego chimerycznym antysensownym oligonukleotydem niż w przypadku oligonukleotydu pełnego typu DNA(Crooke i in., 1995).

w późniejszych badaniach oceniliśmy interakcje antysensownych oligonukleotydów ze strukturalnymi i niestrukturalnymi celami oraz bardziej szczegółowo wpływ tych interakcji Na Rnazę H (Lima and Crooke, 1997). Korzystając z szeregu nietrwałych substratów i analiz Michaelisa-Mentena, byliśmy w stanie ocenić zarówno Wiązanie, jak i rozszczepianie. Wykazaliśmy, że Rnaza E. coli H1 jest dwuniciowym białkiem wiążącym RNA. Kd dla dupleksu RNA wynosił 1,6 µM, KD dla dupleksu DNA 176 µM, a KD dla jednoniciowego DNA 942 µM. Natomiast enzym mógł rozszczepiać RNA tylko w dupleksie RNA-DNA. Wszelkie modyfikacje 2’w antysensownym leku w miejscu cięcia hamowały rozszczepienie, ale znaczne zmniejszenie ładunku i modyfikacje 2′ były tolerowane w miejscu wiązania. Wreszcie, umieszczenie ładunku dodatniego (np. 2 ’ – propoksyaminy) w antysensownym leku zmniejszało powinowactwo i rozszczepienie. Zbadaliśmy również wpływ antysensownych struktur RNA indukowanych oligonukleotydami na aktywność RNazy H1 E. coli (Lima and Crooke, 1997). Jakakolwiek struktura w substracie duplex okazała się mieć znaczący negatywny wpływ na szybkość rozszczepiania. Ponadto, rozszczepienie wybranych miejsc zostało całkowicie zahamowane, co zostało wyjaśnione przez steryczną przeszkodę narzuconą przez pętlę RNA przechodzącą przez drobne lub główne rowki lub heteroduplex. Niedawno sklonowaliśmy i wyrażaliśmy ludzką Rnazę H1. Białko jest homologiczne do RNazy H1 E. coli, ale ma właściwości podobne do tych opisanych dla ludzkiej RNazy H typu 2 (Frank i wsp ., 1994; Wu et al., 1998). Enzym jest stymulowany przez niskie stężenia Mg2+, hamowany przez wyższe stężenia i jest hamowany przez Mn2+ w obecności Mg2+. Jest to 33 kDa w masie cząsteczkowej. Jest to dwuniciowe białko wiążące RNA i wykazuje unikalne preferencje pozycyjne i sekwencyjne dla rozszczepiania (Wu et al., 1999). Dodatkowo klonowano ludzką Rnazę H2, ale do tej pory wykazano, że białko ekspresyjne nie jest aktywne (Frank i wsp., 1998). Bardzo niedawno informowaliśmy o wpływie kilku mutacji wprowadzonych do ludzkiej RNazy H1 na aktywność enzymu (Wu et al., 2000). Tak więc, mamy teraz niezbędne narzędzia, aby zacząć badać rolę ludzkiej RNazy H w procesach biologicznych i farmakologicznych i zacząć opracowywać leki zaprojektowane do skuteczniejszej interakcji z nimi.

wreszcie, przynajmniej w odniesieniu do indukowanej Rnazą H degradacji docelowego RNA, niedawno wykazaliśmy, że w zakresie 1-150 kopii RNA na komórkę, poziom docelowego RNA nie ma wpływu na siłę działania inhibitorów antysensownych (Miraglia, 2000). Wynika to z faktu, że liczba cząsteczek antysensownego leku na komórkę przekracza liczbę kopii RNA o kilka rzędów wielkości. Tak więc inne czynniki muszą ograniczać szybkość.