Aptamery stały się nową kategorią w dziedzinie bioreceptorów ze względu na ich szerokie zastosowanie, od biosensingu po terapeutyki. Opisano kilka odmian ich procesu przesiewania, zwanego SELEX, które mogą dawać sekwencje o pożądanych właściwościach potrzebnych do ich ostatecznego zastosowania.

generowanie jednoniciowej biblioteki oligonukleotydówedit

pierwszy etap SELEX obejmuje syntezę całkowicie lub częściowo randomizowanych sekwencji OLIGONUKLEOTYDOWYCH o pewnej długości otoczonych określonymi regionami, które umożliwiają amplifikację PCR tych randomizowanych regionów i, w przypadku RNA SELEX, transkrypcję randomizowanej sekwencji in vitro. Podczas gdy Ellington i Szostak wykazali, że synteza chemiczna jest zdolna do generowania ~1015 unikalnych sekwencji dla bibliotek oligonukleotydowych w pracy z 1990 r.na temat selekcji in vitro, odkryli, że amplifikacja tych zsyntetyzowanych oligonukleotydów doprowadziła do znacznej utraty różnorodności puli z powodu błędu PCR i defektów w zsyntetyzowanych fragmentach. Pula oligonukleotydów jest amplifikowana i wystarczająca ilość początkowej biblioteki jest dodawana do reakcji tak, że istnieją liczne kopie każdej pojedynczej sekwencji, aby zminimalizować utratę potencjalnych sekwencji wiążących z powodu zdarzeń stochastycznych. Zanim Biblioteka zostanie wprowadzona do target do inkubacji i selektywnej retencji, biblioteka sekwencji musi zostać przekształcona w jednoniciowe oligonukleotydy w celu uzyskania konformacji strukturalnych z właściwościami wiązania docelowego.

inkubacja Docelowaedytuj

bezpośrednio przed wprowadzeniem celu biblioteka jednoniciowych oligonukleotydów jest często podgrzewana i powoli chłodzona, aby przekształcić oligonukleotydy w termodynamicznie stabilne struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe. Po przygotowaniu, randomizowaną bibliotekę inkubuje się z immobilizowanym celem, aby umożliwić Wiązanie oligonukleotyd-cel. Istnieje kilka rozważań dotyczących tego docelowego etapu inkubacji, w tym metoda immobilizacji docelowej i strategie dalszego oddzielania niezwiązanego oligonukleotydu, czas i temperatura inkubacji, warunki buforu inkubacji i stężenia docelowe w porównaniu z oligonukleotydami. Przykłady metod immobilizacji celu obejmują kolumny chromatograficzne powinowactwa, filtry do oznaczania wiązania nitrocelulozy i kulki paramagnetyczne. Ostatnio rozwinęły się reakcje SELEX, w których celem są całe komórki, które są rozszerzane w pobliżu całkowitego zbiegu i inkubowane z biblioteką oligonukleotydów na płytkach do hodowli. Warunki bufora inkubacji są zmieniane w zależności od zamierzonego celu i pożądanej funkcji wybranego aptamera. Na przykład, w przypadku ujemnie naładowanych małych cząsteczek i białek, wysokie bufory soli są używane do przesiewania ładunku, aby umożliwić nukleotydom zbliżyć się do celu i zwiększyć prawdopodobieństwo określonego zdarzenia wiązania. Alternatywnie, jeśli pożądaną funkcją aptamera jest wiązanie białek in vivo lub całych komórek dla potencjalnego zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego, warunki buforu inkubacyjnego podobne do stężeń soli w osoczu in vivo i temperatury homeostatyczne są bardziej prawdopodobne, aby wytworzyć aptamery, które mogą wiązać się In vivo. Inną kwestią w Warunkach bufora inkubacyjnego jest niespecyficzna konkurencja. Jeśli istnieje duże prawdopodobieństwo retencji niespecyficznych oligonukleotydów w warunkach reakcji, niespecyficzni konkurenci, czyli małe cząsteczki lub polimery inne niż biblioteka SELEX, które mają podobne właściwości fizyczne do oligonukleotydów bibliotecznych, mogą być stosowane do zajmowania tych niespecyficznych miejsc wiązania. Zmiana względnego stężenia docelowych i oligonukleotydów może również wpływać na właściwości wybranych aptamerów. Jeśli dobre powinowactwo wiązania do wybranego aptamera nie stanowi problemu, można użyć nadmiaru celu, aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że przynajmniej niektóre sekwencje będą wiązać się podczas inkubacji i zostaną zachowane. Nie zapewnia to jednak selektywnego nacisku na wysokie powinowactwo wiązania, co wymaga nadmiaru biblioteki oligonukleotydów, tak aby istniała konkurencja między unikalnymi sekwencjami dla dostępnych specyficznych miejsc wiązania.

elucja sekwencji wiązania i amplifikacjaedytuj

gdy biblioteka oligonukleotydów została inkubowana z celem przez wystarczający czas, niezwiązane oligonukleotydy są wymywane z unieruchomionego celu, często przy użyciu bufora inkubacyjnego, tak aby specyficznie związane oligonukleotydy zostały zatrzymane. W przypadku zmywania niezwiązanych sekwencji, specyficznie związane sekwencje są następnie eluowane przez tworzenie warunków denaturowania, które sprzyjają rozwijaniu się oligonukleotydu lub utracie konformacji wiązania, w tym przepływaniu w dejonizowanej wodzie, przy użyciu roztworów denaturujących zawierających mocznik i EDTA, lub przez zastosowanie wysokiej temperatury i siły fizycznej. Po elucji wiązanych sekwencji, zachowane oligonukleotydy są odwrotnie transkrybowane do DNA w przypadku RNA lub zmodyfikowanej selekcji zasadowej, lub po prostu gromadzone do amplifikacji w przypadku SELEKSU DNA. Te szablony DNA z eluowanych sekwencji są następnie amplifikowane za pomocą PCR i konwertowane do jednoniciowego DNA, RNA lub zmodyfikowanych zasadowych oligonukleotydów, które są używane jako wstępny wkład do następnej rundy selekcji.

uzyskanie ssDNAEdit

jednym z najbardziej krytycznych etapów procedury SELEX jest uzyskanie jednoniciowego DNA (ssDNA) po etapie amplifikacji PCR. Będzie to służyć jako dane wejściowe do następnego cyklu, więc ważne jest, aby całe DNA było jednoniciowe i jak najmniej zostało utracone. Ze względu na względną prostotę, jedną z najczęściej stosowanych metod jest stosowanie biotynylowanych odwrotnych starterów w etapie amplifikacji, po czym komplementarne nici mogą być związane z żywicą, a następnie elucja drugiej nici ługiem. Inną metodą jest asymetryczny PCR, gdzie etap amplifikacji jest wykonywany z nadmiarem podkładu do przodu i bardzo małym podkładem do tyłu, co prowadzi do wytworzenia większej ilości pożądanego pasma. Wadą tej metody jest to, że produkt powinien być oczyszczony z dwuniciowego DNA (dsDNA) i innego pozostałego materiału z reakcji PCR. Enzymatyczna degradacja niepożądanej nici może być przeprowadzona przez znakowanie tej nici za pomocą startera z sondą fosforanową, ponieważ jest ona rozpoznawana przez enzymy, takie jak egzonukleaza Lambda. Enzymy te następnie selektywnie degradują nitkę oznaczoną fosforanem, pozostawiając nić komplementarną nienaruszoną. Wszystkie te metody odzyskują około 50 do 70% DNA. Szczegółowe porównanie można znaleźć w artykule Svobodová et al. gdzie te i inne metody są porównywane eksperymentalnie. W klasycznym SELEX, proces randomizowanego jednoniciowego generowania biblioteki, inkubacji docelowej i eluacji sekwencji wiązania i amplifikacji opisany powyżej jest powtarzany, aż zdecydowana większość zachowanej puli składa się z sekwencji wiązania docelowego, chociaż często stosowane są modyfikacje i Dodatki do procedury, które są omówione poniżej.

selekcja ujemna lub przeciwnaedit

w celu zwiększenia specyficzności aptamerów wybranych przez daną procedurę SELEX można dodać selekcję ujemną lub przeciwną, etap przed lub bezpośrednio po inkubacji docelowej. W celu wyeliminowania z puli sekwencji o powinowactwie do docelowych składników macierzy immobilizacyjnej, można zastosować selekcję negatywną, w której Biblioteka jest inkubowana z docelowymi składnikami macierzy immobilizacyjnej i zatrzymywane są niezwiązane sekwencje. Selekcja negatywna może być również wykorzystana do wyeliminowania sekwencji, które wiążą cząsteczki lub komórki podobne do celu poprzez inkubację biblioteki oligonukleotydów z analogami docelowymi małych cząsteczek, niepożądanymi typami komórek lub białkami niebędącymi celem i zachowanie niezwiązanych sekwencji.

śledzenie postępu selekcjiedit

aby śledzić postęp reakcji SELEX, liczbę docelowych cząsteczek związanych, która jest równoważna liczbie eluowanych oligonukleotydów, można porównać z szacunkowym całkowitym wkładem oligonukleotydów po elucji w każdej rundzie. Liczbę eluowanych oligonukleotydów można oszacować za pomocą estymacji stężenia elucyjnego za pomocą absorbancji długości fali 260 nm lub znakowania fluorescencyjnego oligonukleotydów. Gdy reakcja SELEX zbliża się do zakończenia, frakcja biblioteki oligonukleotydowej, która wiąże cel, zbliża się do 100%, tak że liczba eluowanych cząsteczek zbliża się do całkowitego oszacowania wejściowego oligonukleotydu, ale może zbiegać się z mniejszą liczbą.

zastrzeżenia i rozważania

niektóre reakcje SELEX mogą generować sondy, które są zależne od regionów wiążących Starter dla tworzenia struktury wtórnej. Istnieją aplikacje aptamerowe, dla których pożądana jest krótka sekwencja, a tym samym obcinanie podkładu. Postęp w stosunku do oryginalnej metody pozwala bibliotece RNA na pominięcie stałych regionów starterowych, które mogą być trudne do usunięcia po procesie selekcji, ponieważ stabilizują struktury drugorzędowe, które są niestabilne, gdy są utworzone przez sam region losowy.