Aptâmeros emergiram como uma nova categoria no campo dos biorreceptores devido às suas amplas aplicações que vão desde a biosensagem à terapêutica. Várias variações de seu processo de triagem, chamado SELEX, foram relatadas que podem produzir sequências com propriedades desejadas necessárias para seu uso final.

Gerar único ociosos oligonucleotide libraryEdit

O primeiro passo da SELEX envolve a síntese de totalmente ou parcialmente randomizados oligonucleotide seqüências de alguns de comprimento, ladeado por regiões definidas, que permitem a amplificação por PCR de aqueles randomizados regiões e, no caso de RNA SELEX, transcrição in vitro da randomizados sequência. Enquanto Ellington e Szostak demonstrado que a síntese química é capaz de gerar ~1015 únicas sequências para oligonucleotide bibliotecas em 1990 papel in vitro a seleção, eles descobriram que a amplificação destes oligonucleotídeos sintetizados levou a uma perda significativa de piscina diversidade devido a PCR preconceito e defeitos em fragmentos sintetizados. O pool de oligonucleótidos é amplificado e uma quantidade suficiente da biblioteca inicial é adicionada à reação para que haja inúmeras cópias de cada sequência individual para minimizar a perda de potenciais sequências de ligação devido a eventos estocásticos. Antes que a biblioteca seja introduzida como alvo para incubação e retenção seletiva, a biblioteca de seqüência deve ser convertida em oligonucleotídeos de cadeia única para alcançar conformações estruturais com propriedades de ligação alvo.

incubationEdit alvo

imediatamente antes da introdução ao alvo, a biblioteca de oligonucleótidos de cadeia simples é frequentemente aquecida e arrefecida lentamente até à renaturação dos oligonucleótidos em estruturas secundárias e terciárias termodinamicamente estáveis. Uma vez preparada, a biblioteca aleatória é incubada com alvo imobilizado para permitir a ligação oligonucleotídeo-alvo. Existem várias considerações para esta fase-alvo de incubação, incluindo o método de imobilização-alvo e estratégias para subsequente separação dos oligonucleótidos não ligados, tempo e temperatura de incubação, condições de tampão de incubação e concentrações de alvo versus oligonucleótidos. Exemplos de métodos de imobilização alvo incluem colunas de cromatografia de afinidade, filtros de ensaio de ligação de nitrocelulose e contas paramagnéticas. Recentemente, reações SELEX foram desenvolvidas onde o alvo são células inteiras, que são expandidas perto da confluência completa e incubadas com a biblioteca de oligonucleótidos em placas de cultura. As condições do tampão de incubação são alteradas com base no alvo pretendido e na função desejada do aptamer seleccionado. Por exemplo, no caso de pequenas moléculas e proteínas carregadas negativamente, tampões de sal elevados são usados para triagem de carga para permitir que os nucleótidos se aproximem do alvo e aumentem a chance de um evento de ligação específico. Alternativamente, se a função aptamer desejada for a ligação às proteínas in vivo ou a células inteiras para potenciais aplicações terapêuticas ou diagnósticas, as condições tampão de incubação semelhantes às concentrações de sal plasmático in vivo e às temperaturas homeostáticas são mais propensas a gerar aptamers que se podem ligar in vivo. Outra consideração nas condições de tampão de incubação são os concorrentes não específicos. Se houver uma alta probabilidade de retenção de oligonucleótidos não específicos nas condições de reação, concorrentes não específicos, que são pequenas moléculas ou polímeros que não a biblioteca SELEX que têm propriedades físicas similares aos oligonucleótidos da biblioteca, podem ser usados para ocupar esses locais de ligação não específicos. A variação da concentração relativa de alvos e oligonucleótidos também pode afetar as propriedades dos aptâmeros selecionados. Se uma boa afinidade de ligação para o aptâmero selecionado não for uma preocupação, então um excesso de alvo pode ser usado para aumentar a probabilidade de que pelo menos algumas sequências se ligarão durante a incubação e serão retidas. No entanto, isso não fornece pressão seletiva para a alta afinidade de ligação, o que requer que a biblioteca oligonucleotídeo seja em excesso, de modo que haja concorrência entre sequências únicas para locais de ligação específicos disponíveis.

eluição da sequência de ligação e amplificação edit

Uma vez que a biblioteca de oligonucleótidos tenha sido incubada com o alvo durante tempo suficiente, os oligonucleótidos não ligados são lavados do alvo imobilizado, muitas vezes utilizando o tampão de incubação para que os oligonucleótidos especificamente ligados sejam mantidos. Com sequências não ligadas lavadas, as sequências especificamente ligadas são então eluídas criando condições de desnaturação que promovem o desenvolvimento de oligonucleótidos ou a perda de conformação de ligação, incluindo o fluxo em água desionizada, utilizando soluções de desnaturação contendo ureia e EDTA, ou aplicando calor elevado e força física. Após a eluição de sequências ligadas, os oligonucleótidos retidos são transcritos ao DNA no caso do RNA ou seleções de base modificadas, ou simplesmente coletados para amplificação no caso do SELEX de DNA. Estes modelos de DNA de sequências eludidas são então amplificados através da PCR e convertidos em DNA de cadeia única, RNA, ou oligonucleótidos de base modificados, que são usados como a entrada inicial para a próxima rodada de seleção.

obtendo ssDNAEdit

um dos passos mais críticos no procedimento SELEX é obter DNA de cadeia única (ssDNA) após o passo de amplificação PCR. Isso servirá como entrada para o próximo ciclo, por isso é de importância vital que todo o DNA seja isolado e o mínimo possível seja perdido. Devido à relativa simplicidade, um dos métodos mais utilizados é usando o inverso primers no passo de amplificação, após o que as vertentes complementares podem ser vinculados a uma resina seguido de eluição da outra vertente com soda cáustica. Outro método é a PCR assimétrica, onde a etapa de amplificação é realizada com um excesso de iniciador dianteiro e muito pouco iniciador reverso, o que leva à produção de mais da cadeia desejada. Uma desvantagem deste método é que o produto deve ser purificado a partir de ADN de cadeia dupla (dsDNA) e de outras matérias deixadas da reacção PCR. A degradação enzimática da cadeia indesejada pode ser realizada marcando esta cadeia usando um iniciador à prova de fosfato, uma vez que é reconhecida por enzimas como a exonuclease Lambda. Estas enzimas degradam selectivamente a cadeia marcada com fosfato, deixando intacta a cadeia complementar. Todos estes métodos recuperam aproximadamente 50 a 70% do DNA. Para uma comparação detalhada, consulte o artigo de Svobodová et al. onde estes e outros métodos são comparados experimentalmente. Clássica, a SELEX, o processo de estudo randomizado único ociosos biblioteca de geração, alvo de incubação, e a sequência de ligação de eluição e amplificação descritas acima são repetidos até que a grande maioria dos mantidas piscina consiste em destino de ligação sequências, apesar de existirem modificações e adições para o procedimento de que são frequentemente utilizados, que são discutidos a seguir.

negativo ou contra-selectionEdit

a fim de aumentar a especificidade dos aptâmers selecionados por um determinado procedimento SELEX, uma seleção negativa, ou contra-seleção, passo pode ser adicionado antes ou imediatamente após a incubação alvo. Para eliminar sequências com afinidade para componentes da matriz de imobilização alvo do pool, a seleção negativa pode ser usada onde a Biblioteca é incubada com componentes da matriz de imobilização alvo e sequências não ligadas são mantidas. A seleção negativa também pode ser usada para eliminar sequências que se ligam a moléculas ou células alvo incubando a biblioteca de oligonucleótidos com pequenos análogos de moléculas alvo, tipos de células indesejáveis, ou proteínas não alvo e mantendo as sequências não ligadas.

de Rastreamento seleção progressionEdit

Para controlar o progresso de um SELEX reação, o número de destino vinculado moléculas, que é equivalente ao número de oligonucleotídeos eluídas, pode ser comparado com o total estimado de entrada de oligonucleotídeos seguinte eluição em cada rodada. O número de oligonucleótidos eludidos pode ser estimado através de estimativas da concentração de eluição através da absorvância de comprimento de onda de 260 nm ou da rotulagem fluorescente de oligonucleótidos. À medida que a reação de SELEX se aproxima da conclusão, a fração da biblioteca de oligonucleótidos que liga o alvo aproxima-se 100%, tal que o número de moléculas eludidas se aproxima da estimativa de entrada total de oligonucleótidos, mas pode convergir em um número menor.

Caveats and considerationsEdit

Some SELEX reactions can generate probes that are dependent on primer binding regions for secondary structure formation. Existem aplicações aptamer para as quais uma sequência curta, e assim a truncação primer, é desejável. Um avanço no método original permite que uma biblioteca de RNA omita as regiões de primer constantes, que podem ser difíceis de remover após o processo de seleção porque estabilizam estruturas secundárias que são instáveis quando formadas apenas pela região aleatória.