resultados

estudámos ratos do tipo selvagem (WT), heterozigóticos v2rv31r/WT e homozigóticos v2r31r/V2R31R. Os ratos mutantes tinham números e frequências normais de células alfaβ t esplénicas maduras e timócitos em cada fase de desenvolvimento. Devido à falta de marcadores congênicos, as proteínas TCRß não podem ser identificadas pelo alelo que as codifica, nem se elas incluem regiões Cß1 versus cß2. Assim, realizamos citometria de fluxo usando anticorpos anti-v2 e anti-V31 para quantificar células expressando proteínas V2+ e V31+ TCRß. Determinámos os timócitos CD4+ e CD8+ (SP) únicos-positivos, uma vez que são células αβ T adultas e ingénuas. Reflectindo os dados publicados (8, 9), detectámos uma pequena fracção (0, 11%) de células que mancharam com ambos os anticorpos em ratinhos com TMA (Fig. 1 B E C), que é consistente com uma pequena população de células V2+V31+ αβ T. Observou-se um aumento de 12, 4 vezes da fracção destas células em ratinhos V2R31R/WT, e um aumento de 32, 8 vezes em ratinhos V2R31R/V2R31R (Fig. 1 B E C). Estas frequências elevadas de células duais-TCRß + corresponderam com a maior utilização de v2 e V31 em cadeias TCRß expressas (Fig. 1 D-F). Estes dados demonstram que o aumento da qualidade RSS de dois Vßs no mesmo Alelo aumenta o seu rearranjo e, consequentemente, a fração de células T expressando dois tipos distintos de proteínas TCRß. Como o repertório Vß dos timócitos SP reflete os níveis relativos que segmentos Vß individuais recombinam (10), o uso preferencial de V31 sobre V2 revela que V31R outcompetes V2R para rearranjo. Isto pode dever–se a uma maior acessibilidade da v31 (11) ou à interacção da V31 com segmentos Dß–Jß antes de a contracção da TCRß locus situar a V2 perto dos segmentos Dß-Jß. Notavelmente, o aumento superior a duas vezes destas células duais em ratos v2r31r/V2R31R em comparação com ratos V2R31R/WT implica que dois rearranjos V(D)Jß distintos podem contribuir para a expressão TCRß a partir do mesmo Alelo.

para determinar se um único Alelo TCRß pode realmente suportar a expressão de proteínas TCRß de dois rearranjos V(D)Jß diferentes, analisamos ratos onde um alelo TCRß é inativado pela eliminação do potenciador TCRß (Eß) (12, 13). Nós ratos assayed carregando o alelo Eß-deletado em frente a um alelo WT, um alelo com uma substituição RSS de V2 (V2R) ou V31 (V31R), ou ambos (8). Detectámos uma pequena percentagem (0, 094%) de timócitos V2+V31+ SP em ratos WT/EβΔ (Fig. 2 A E B), representando potencialmente uma população rara de células que expressam duas proteínas TCRß diferentes do mesmo Alelo WT. Independentemente disso, observámos células V2+V31+ com uma frequência 1, 9 vezes maior em ratinhos V2R/EβΔ e com uma frequência 4, 8 vezes maior em ratinhos V31R/EβΔ (Fig. 2 A E B). Assim, o aumento da qualidade de qualquer um dos Vß RSS eleva a fração de células que expressam proteínas V2+ e V31+ TCRß. Notavelmente, detectámos um aumento de 14, 4 vezes da frequência de células V2+V31+ em ratos v2rv31r/EβΔ relativamente a ratos WT / EβΔ (Fig. 2 A E B), indicando que a melhoria da qualidade de dois Vß RSSs sinergisticamente aumenta a percentagem de células que expressam proteínas V2+ e V31+ TCRß. De facto, apagar parte do V31 RSS no Alelo V2R (o alelo V2R31Δ; Fig. 2C) reduz drasticamente a frequência de células V2+V31+ a níveis equivalentes ou inferiores aos dos ratos V2R/EβΔ (0, 178% versus 0, 135%; Fig. 2 A E B). Coletivamente, estes dados confirmam que o alelo v2r31r promove a expressão de duas proteínas TCRß distintas de dois rearranjos V(D)Jß diferentes em um único Alelo.Fig. 2. expressão de duas cadeias TCRß diferentes do alelo V2RV31R. (A e B) Representante de parcelas (A) e de quantificação (B) de SP timócitos expressando V2+ e V31+ TCRß cadeias (n ≥ 6 ratos por grupo; one-way ANOVA, Tukey vários posttests; ns, não significativo; ****P < 0.0001). C) esquemático da cadeia sensorial e truncamento da região V31 do alelo V2R31Δ, com o V31 RSS indicado em azul. D) Descrição dos eventos de recombinação que podem resultar em duas cadeias TCRß expressas a partir de um alelo. RSSs são indicados como triângulos. Os dados em A E B são compilados a partir de quatro experimentos.o nosso estudo demonstra que um mecanismo genético intrínseco governa a montagem e a expressão monogénicas. Nós mostramos que Vsss de má qualidade cooperam para limitar a montagem e expressão de dois genes TCRß distintos de um alelo. Anteriormente, demonstrámos que a frequência de recombinação Vß estocasticamente contida no VSS de baixa qualidade antes da inibição do feedback para diminuir a montagem bialélica e a expressão dos genes TCRß (8). Agora concluímos que os VSS de baixa qualidade também diminuem a incidência que tanto o V31 quanto o vß a montante recombinam no mesmo Alelo. Estes rearranjos poderia envolver 1) uma deletional V2 rearranjo para o Dß1–Jß1–Cß1 cluster e um inversional V31 rearranjo para o Dß2–Jß2–Cß2 cluster, ou 2) uma inversional V31 rearranjo para o Dß1–Jß1–Cß1 cluster, que inverte uma parte do locus que contém o Dß2–Jß2–Cß2 de cluster e, em seguida, um inversional V2 rearranjo para o Dß2–Jß2–Cß2 cluster (7) (Fig. 2D). Para atingir a montagem e expressão monogénica do TCRß, este mecanismo genético baseado no RSS pode funcionar com processos epigenéticos que foram implicados para impor a recombinação monoalélica do Vß. Por exemplo, foi proposto que as interações dinâmicas dos segmentos Vß com a lâmina nuclear reduz a eficiência de recombinação Vß reprimindo a acessibilidade cromatina Vß e o looping cromossômico entre os grupos Dß–Jß e os segmentos vß upstream (14, 15). Neste contexto, os Vß RSS de má qualidade poderiam reduzir a probabilidade de dois rearranjos Vß ocorrerem num Alelo quando a V31 e um segmento Vß a montante são acessíveis e o Vß a montante é colocado em circuito próximo dos segmentos Dß-Jß. Assim, as propriedades do RSSs podem estar subjacentes à montagem monogênica e expressão de proteínas mamíferas Tcrδ, Tcrδ e Igλ em mamíferos, e proteínas Ig em peixes cartilaginosos. Adicionalmente, os RSSs V podem igualmente contribuir para a exclusão isotípica Igk e Igλ nas células B.