matriz Extracelular preparação e reologia

O ECM é composto de uma rede de gelatina e fibrina. Para preparar os componentes ECM, uma solução de gelatina a 15 wt/v% (tipo a, 300 florescimento da pele suína, Sigma) é produzida pela adição de pó de gelatina a uma solução quente (70 °C) de DPBS (solução salina tamponada com fosfato de 1x Dulbelco sem cálcio e magnésio). Permite-se que a gelatina se dissolva completamente agitando durante 12 h a 70 °C, ajustando-se então o pH para 7, 5 utilizando 1 m de NaOH. A solução é estéril filtrada e armazenada a 4 ° C em alíquotas para utilização posterior na fundição (<3 meses). Uma solução de fibrinogénio (50 mg/mL) é produzida pela dissolução da proteína plasmática liofilizada do sangue bovino (Millipore) a 37 °C em DPBS estéreis sem cálcio e magnésio. A solução mantém-se a 37 °C sem agitação durante pelo menos 45 minutos para permitir a dissolução completa. A solução de transglutaminase (tg) (60 mg/mL) é preparada dissolvendo o pó liofilizado (Moo Gloo) em DPBS sem cálcio e magnésio e misturando-se suavemente durante 20 segundos. a solução é então mantida a 37 °C durante 20 minutos e estéril filtrada antes da utilização. Uma solução-mãe CaCl2 (250 mM) é preparada dissolvendo o pó CaCl2 em DPBS sem cálcio e magnésio (Corning). Para preparar a solução-mãe da trombina, a trombina liofilizada (Sigma Aldrich) é reconstituída a 500 U/mL utilizando DPBS esterilizados e conservada a -20 °C. as alíquotas de trombina são descongeladas imediatamente antes da utilização.

um reômetro de tensão controlado (DHR-3, instrumentos TA, Novo Castelo, DE) com 40 mm de diâmetro, cone de 2° e geometria da placa é usado para medições de rheologia de tinta. Os módulos de armazenamento de cisalhamento (G’) e de perda (G”) são medidos a uma frequência de 1 Hz e uma estirpe oscilatória (γ) de 0,01. As varreduras temporais são conduzidas através da rápida colocação de uma solução ECM pré-misturada que contém trombina na placa do Peltier mantida a 37 °C. são necessárias formulações de tinta

duas tintas para a bioprinagem 3D de modelos de PT perfusáveis. Uma tinta, que é usada para criar a junta do chip de perfusão, é composta por um elastômero de silicone de duas partes (SE 1700, DOW Chemical) com uma base de 10:1 para catalisar (em peso) que é homogeneizado usando um misturador centrífugo por 2 minutos (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Japão). A tinta de silicone é impressa a 2 h de mistura com catalisador. Esta tinta é carregada numa seringa (EFD Inc., East Providence, RI) e centrifugado para remover quaisquer bolhas de ar antes de imprimir à temperatura ambiente. A outra tinta, uma tinta fugitiva usada para imprimir o túbulo, é composta por 38 wt % plural F127 (Sigma) e 100 U/mL de trombina em água desionizada, ultrafiltrada (DIUF). A tinta fugitiva é tingida de rosa através da adição de um corante do reator de risco para visualização na Fig. 1 e Movie S1. Para preparar esta tinta, a 40% em peso de Pluronic F127 solução na água é homogeneizada utilizando um Thinky mixer até que o pó esteja completamente dissolvido, e, posteriormente, armazenadas a 4 °C. Antes de utilizar, de 2000 U/mL de solução de trombina é adicionado para o fugitivo (Pluronic) de tinta, na proporção de 1:20, e homogeneizadas utilizando um Thinky mixer. A tinta fugitiva é então carregada numa seringa (EFD Inc., East Providence, RI) a 4 °C e centrifugado para remover quaisquer bolhas de ar. Antes da impressão, Esta tinta é equilibrada à temperatura ambiente durante, pelo menos, 15 minutos.as construções de túbulos proximais, perfusáveis em 3D, são fabricadas utilizando um bioprinador 3D multimaterial personalizado, equipado com quatro cabeças de impressão independentes montadas num pórtico de 3 eixos, guindaste controlado por movimento com um volume de construção de 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). As tintas são alojadas em barris de seringa separados aos quais são fixadas tubeiras de diferentes dimensões (diâmetro de 50 µm–410 µm) através de um luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). As tintas são extrudidas através de agulhetas de deposição através da aplicação da pressão do ar (800 sistema de distribuição Ultra, EFD Inc., East Providence, RI, EUA), variando de 10-90 psi, correspondendo a velocidades de impressão entre 1 mm/s e 5 cm/s. primeiro imprimimos a junta personalizada do chip de perfusão, depositando a tinta de silicone através de uma tubeira de 410 µm afunilada em lâminas de vidro de 50 mm × 75 mm. O projeto da junta é criado usando um script MATLAB personalizado que gera G-code para uma estrutura final da junta. Após a impressão, a junta das pastilhas de perfusão é curada a 80 °C numa estufa para >1 h e armazenada à temperatura ambiente antes da utilização.

padronizar PTs 3D dentro do chip de perfusão requer uma combinação de vazar o ECM e imprimir a tinta fugitiva. Em primeiro lugar, a solução ECM é criada pela combinação de 10 mg/mL de fibrinogénio, 7, 5% em wt de gelatina, 2, 5 mM CaCl2 e 0, 2 wt% TG. Esta solução é então equilibrada a 37 ° C durante 15-20 minutos antes de ser utilizada para melhorar a clareza óptica do ECM25. Em seguida, a solução é rapidamente misturada com trombina numa razão de 500:1, resultando numa concentração final de trombina de 1 U/mL. Dentro de 2 minutos a 37 ° C, segue-se a polimerização do fibrinogénio em gel de fibrina. Por esta razão, a solução ECM deve ser colocada na base do chip de perfusão imediatamente após a mistura com trombina. A camada ECM base é então permitida a secar ligeiramente sob nitrogênio, de modo que forma uma superfície plana. A tinta fugitiva plural F127 (com 100 U/mL de trombina) é impressa na camada base ECM sob a forma de um rolo enrolado (túbulo) utilizando um bocal cónico de 200 µm. Um script Python personalizado (MeCode) é usado para especificar o ‘toolpath’ no código-G. Logo após a impressão de tinta fugitiva, os pinos de perfusão ocos de metal ligados à Junta de silicone entram em contacto com a tinta impressa. Uma camada superior de ECM é então formada moldando a solução ECM sobre o túbulo impresso, tal como descrito acima, a uma distância de 1-2 mm da altura das paredes da junta. As células If, tais como HNDFs, são incorporadas no ECM (Fig. S5), são misturados directamente após o período de equilíbrio, antes da mistura de trombina e subsequente vazamento. Depois que a camada superior ECM é moldada, a construção é coberta com uma lâmina de vidro para evitar a evaporação ou contaminação e é mantida a 37 °C por 1 h para permitir a polimerização de fibrina para terminar e TG para cruzar a rede. A construção é então arrefecida a 4 ° C durante 15-20 minutos para liquefazer a tinta fugitiva impressa, que é expelida do dispositivo utilizando meios de células Frias, deixando para trás condutas abertas que servem como a rede tubular desejada embutida no ECM com ou sem células no espaço ECM extra-tubular.

Usando este método, também produzimos arquiteturas 3D em uma sequência de compilação camada-a-camada. Por exemplo, cada camada individual da estrutura de três camadas mostrada na figura. O S10 foi construído utilizando um protocolo de impressão modificado que incorpora os materiais e métodos anteriormente discutidos. Depois de imprimir os primeiros túbulos com tinta fugitiva, uma camada de ECM é moldada sobre a impressão e permite que 20 minutos gelem a 37 °C antes que a próxima camada tubular proximal seja impressa com tinta fugitiva em cima da camada recentemente gelada. Esta construção sucessiva introduz geometria 3D e permite a evacuação de todos os canais de forma independente após a construção. Corantes de reator de risco aquoso são perfurados através dos canais e excitados com luz UV para visualização.

para completar o processo de montagem de pedaços de tecido 3D, cada construção PT é colocada sobre uma base de aço inoxidável machinada e uma tampa acrílica espessa é colocada em cima. A tampa e a base são unidas por quatro parafusos, formando um selo em torno da Junta de silicone impressa. Em seguida, o tubo peristáltico estéril de duas paragens (PharMed BPT, 0,25 mm de diâmetro interno) é preenchido com meio e ligado à saída de um filtro estéril que está ligado a um barril de seringa de 10 ml (EFD Nordson), que serve como reservatório de meio. PTEC media (projetada para o crescimento, assim ATCC formulação, além de 1% FBS, 1% aprotinin, e de 1% anti-anti) que tem sido equilibrar para >3 h em uma incubadora a 37 °C, 5% CO2 é adicionado à mídia reservatório e a tubulação do reservatório está ligado à tomada do chip (metal oco de perfusão (pin). Uma seringa é então utilizada para exercer uma ligeira pressão sobre o meio do corpo, forçando-o a entrar e a encher completamente o tubo ligado. Encher o tubo com meios antes de conectá-lo ao circuito impede a introdução de bolhas de ar no sistema. Para completar o circuito de perfusão, o tubo de silicone do reservatório Está ligado ao pino de perfusão de metal de entrada no chip. Adicionam-se pinças de pinças à entrada e à saída do chip de perfusão para evitar um fluxo descontrolado quando desligado da bomba peristáltica, o que pode danificar o epitélio ou permitir a entrada de bolhas de ar no sistema. O reservatório do meio é sempre equilibrado com as condições atmosféricas da incubadora por meio de um filtro estéril em cima do reservatório do meio.

cultura celular

Ptec Human immortalized (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) são cultivados de acordo com as instruções do ATCC e são utilizados para todos os estudos modelo PT até a passagem 20. Para a análise da expressão genética, utilizam-se células cancerígenas renais primarias humanas (ATCC HTB-44), Ptec imortalizadas (RPTEC-TERT1, Evercyte) e células cancerígenas renais a498 (ATCC HTB-44), De acordo com as instruções do Fornecedor. Os fibroblastos dérmicos neonatais humanos (HNDF), expressando GFP (Angio-Proteomie) são cultivados de acordo com as instruções do fornecedor e usados até a passagem 15.

análise da expressão genética

Humanos primária RPTEC (Célula Ciência), imortalizado RPTEC-TERT1 (Evercyte) e A498 (ATCC HTB-44) renal, câncer de células são cultivadas em placa de 96 poços de placas de acordo com as instruções do fabricante e recolhidos no Dia 3 pós-confluency substituindo meio de cultura com 100 µl/poço de 1x RNA lise mistura (QuantiGene Exemplo de Processamento de Kit, QS0101). Em seguida, 40 µl de diluente é misturado com um mRNA de captura magnética conjunto de esferas (Panomics QuantiGene Plex Conjunto 12631, número de catálogo 312631), incubadas durante a noite, processados para branched DNA amplificação, e analisados de acordo com as instruções do fabricante (Panomics QuantiGene Plex kit de Ensaio, QP1015). A sonda PPIB é usada como um gene doméstico para a normalização. Os dados relativos à intensidade de fluorescência (FI) são apresentados como desvio médio e padrão de 3 replicados biológicos.

A análise da citoquina do perfusato mediano

o perfusato mediano é recolhido de um túbulo durante um período de 25 dias após a semeadura das células e armazenado a -80 °C antes da análise. Para citocinas de perfil, sobrenadante são descongeladas em gelo, diluído 2x no exemplo de tampão de diluição (BioRad catálogo #M60-009RDPD) e analisados por Luminex de base tecnológica ELISA usando o Bio-Plex Pro™ Humanos Quimiocina IL-6 (Set #171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) e MCP-1 (Set #171-BK36MR2) e o Bio-Plex 200 Sistemas (BioRad), de acordo com as instruções do fabricante. Os dados são reportados como concentrações médias de citoquinas e desvios-padrão dos triplicados técnicos.

Epitelialização e cultura longitudinal

cada construção de PT 3D é perfundida durante várias horas com meio PTEC na incubadora antes de carregar / semear células. Os ptec (PTEC / TERT1, ATCC) são tripsinizados a partir da sua placa de cultura e concentrados em meios para ~2 × 107 células/mL. A suspensão celular é então carregada no chip de perfusão através da saída(Fig. S3b, c). A construção carregada é colocada lateralmente na incubadora por várias horas e invertida 180° ao longo de vários intervalos de meia hora para permitir a semeadura uniforme das paredes do túbulo, em seguida, incubada no túbulo sem fluxo durante a noite. No dia seguinte, as células não aderentes são despejadas do túbulo sob fluxo por gravidade. A perfusão de meios frescos é então iniciada e as células restantes começam a aglomerar-se e, em seguida, crescer a partir dessas colónias (Fig. S3f) até atingirem a confluência cerca de 3 semanas após a semeadura(Fig. S3k). Durante a fase de crescimento, os Ptec são alimentados com meios PTEC preparados de acordo com as orientações do ATCC mais 1% de aprotinina (EMD Millipore, usado para retardar a degradação do ECM), 1% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-Antimicótico (Gibco). Após a maturação, a FBS é removida, e a ptecs é embalada em um epitelial monolayer apertado (filme S2). No dia 1 após a semeadura, os PTECs são expostos a um fluxo contínuo e unidireccional de 1 µl / min, o que equivale a tensões transversais que variam entre 0,1 e 0,5 Dines / cm2, dependendo da secção transversal do túbulo. O meio é alimentado através de uma bomba peristáltica em circuito fechado e alterado a cada 2 dias.o estudo de captação da albumina

a captação da albumina é avaliado para os modelos 3D de PT impressos, bem como para os controlos de 2D. O primeiro controle consiste em PTECs cultivados em plástico de cultura de tecidos, enquanto o segundo controle consiste em PTECs cultivados em nosso ECM. Em cada caso, os PTECs são cultivados para confluência e podem amadurecer em meio livre de soro. A albumina sérica humana conjugada com FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) é suspensa em meio PTEC a 50 µg/mL. Todas as amostras são incubadas com HSA-FITC nos seus meios durante 2 h (no caso de perfusão, é perfundida através do lúmen aberto). Após a exposição, todas as amostras são lavadas com 3x de volume e depois tripsinizadas com 10x de tripsina para recolher as células individuais. As células são fixas e contrastadas com anticorpos primários e secundários para a megalin (o quadro S2 lista os anticorpos específicos utilizados). As células dessas amostras, e as células nuas, são analisadas por citometria de fluxo (BD LSR Fortessa) e os dados são coletados a partir de n = 10 mil células por amostra. Para obter imagens de HSA-FITC e megalin em PTECs, as amostras são fixadas com formalina em vez de serem trisinizadas após a etapa de lavagem. Essas amostras são contrastadas para megalin e fotografadas usando microscopia confocal (Zeiss LSM710).

Ciclosporina A testing

the effect of CysA on both 2D controls and bioprinted 3D PTs is explored. Em 2D, as células são semeadas em um formato de 96 poços em plástico de cultura de tecidos e cultivadas para confluência. Eles são alimentados pela mídia de acordo com as diretrizes da ATCC. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) é suspenso em seus meios de comunicação em várias concentrações e incubados com as células por 24 h. A viabilidade do ensaio utilizando – (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium), na presença de phenazine methosulfate (MTS) é executado 24 h marca pós-exposição. Este ensaio é completado em PTECs no início da confluência, dando CysA às células no dia em que elas atingiram confluência, bem como no final da confluência, dando CysA vários dias depois que elas atingiram confluência. Notavelmente, os resultados de toxicidade são semelhantes para cada caso (Fig. 5n). Para PTs 3D, CysA é alimentado em várias concentrações através do lúmen aberto de túbulos maduros após atingir confluência (a ~3 semanas), onde nenhum soro é incluído no meio por um mínimo de 10 dias. À exposição pós-CysA de 24 h, realiza-se um teste de estanquidade FITC-dextrano (a seguir descrito) para avaliar e quantificar as perturbações à função de barreira dos PTECs. Logo a seguir, o PT é fixado utilizando formalina tamponada a 10% para 1 h e para actin e DAPI com contador (o quadro S2 lista as manchas específicas utilizadas).

Diffusional permeabilidade medições

Para avaliar a função de barreira do epitélio em 3D, diffusional permeabilidade é quantificada por perfusing PTEC mídia em abrir lúmen contendo 25 µg/mL FITC conjugado de 70 kDa dextran (FITC-Dex, Sigma produto 46945) a uma taxa de 15 µL/min 3 min e 1 µL/min, posteriormente, para ~30 a 45 min. Todo o ensaio é realizado em imagens de células vivas com o túbulo e o ECM circundante no campo de visão(Fig. S9). O padrão de difusão de FITC-Dex é detectado usando um microscópio fluorescente de Campo Largo (Zeiss Axiovert 40 CFL). Imagens de fluorescência são captadas antes da perfusão e a cada 3 a 5 minutos durante um período de 30 a 45 minutos. Diffusional permeabilidade do FITC-Dex é calculado por meio da quantificação das alterações na intensidade de fluorescência ao longo do tempo utilizando a seguinte equation34;

Pd é o diffusional coeficiente de permeabilidade, I1 é a intensidade média em um primeiro momento, I2 é uma intensidade média em t ~ 30 a 45 min, Ib é fundo de intensidade (imagem tirada antes da perfusão de FITC-Dex), e d é o diâmetro do canal. Outros investigadores relataram que os PTECs podem reabrir a dextran39, o que levaria a valores ligeiramente mais elevados para a permeabilidade de difusão medida.investigámos também as propriedades de barreira dos nossos túbulos alinhados epiteliais utilizando um composto de baixo peso molecular, a inulina (4, 5 kDa) que não é reabsorvida nem secretada in vivo pelos PTECs utilizando o mesmo método descrito acima. Especificamente, a inulina-FITC (produto Sigma F3272) é dissolvida em meio PTEC aquecido a 100 µg/mL e perfundida no lúmen aberto a uma taxa de 20 µL/min durante 3 min e 1, 5 µL/min durante ~15 min. Todo o ensaio é realizado em imagens de células vivas com o túbulo e o ECM circundante no campo de visão(Fig. S7). O padrão de difusão da FITC-inulina é detectado usando um microscópio fluorescente de Campo Largo (Leica). As imagens de fluorescência são captadas com uma fonte de luz e uma fase controlada pelo movimento antes da perfusão e a cada 3 a 5 minutos durante o período de 15 minutos para a recolha de medições técnicas em triplicado.

microscopia electrónica

para microscopia electrónica de transmissão (met), TECS em arquitecturas 2D ou 3D ou tecido renal humano saudável obtidos a partir de uma biópsia padrão antes do transplante são fixados utilizando 2,5% de glutaraldeído, 1,25% de paraformaldeído e 0,03% de ácido picrico em tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M (pH 7.4) durante um mínimo de várias horas. As pequenas amostras (1 mm × 1 mm) são removidas e lavadas em tampão de cacodilato de 0,1 M e banhadas em 1% de osmiumtetroxide (OsO4) (EMS) e 1.5% de potassiumferrocianida (Kfecn6) (Sigma) durante 1 h, lavada em água 3x e incubada em acetato de uranilo (EMS) com 1% de água durante 1 h, seguida de 2 lavagens em água e subsequente desidratação em diferentes graus de álcool (10 min cada; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 100%). As amostras são então colocadas em propilenóxido (EMS) durante 1 h e incubadas durante a noite numa mistura 1:1 de propilenóxido e TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Canada). No dia seguinte, As amostras são incorporadas em TAAB Epon e polimerizadas a 60 ° C durante 48 horas. Secções ultratinas (cerca de 60 nm) são cortadas num microtoma de Reichert Ultracut-s, colocadas em grades de cobre manchadas com citrato de chumbo e examinadas num microscópio electrónico de transmissão JEOL 1200EX e as imagens são gravadas com uma câmara CCD AMT 2k. A análise de imagem é realizada usando o software ImageJ.

para microscopia electrónica de varrimento (SEM), os PTECs perfundidos em 3D são fixados utilizando formalina tamponada a 10% durante 1 h. As amostras são finas em fatias (~1 mm de espessura) para expor as células que circunscrevem o lúmen aberto. O fixador é lavado utilizando PBSx2 e subsequente desidratação em diferentes graus de etanol (20 minutos cada; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 100%). As amostras são então colocadas em etanol a 50% e em hexametildisilazano a 50% durante 30 minutos, seguidas de HMDS a 100% durante 3 × 30 minutos. Todas as etapas são realizadas em um recipiente de vidro fechado e selado. Após a lavagem final com HMDS, as amostras são removidas e colocadas num recipiente aberto com N2 na tampa da chaminé para secar. Amostras secas são montadas em suportes de alfinete de alumínio usando fita condutiva de carbono, sputter revestido com ouro, e fotografado com um sem Tescan Vega.é utilizada a imunossupressão seguida de Microscopia confocal para avaliar a localização celular das proteínas em modelos 2D e 3D PTEC. Antes da imunoformação, cada construção é lavada com PBS e depois fixada durante 20 minutos a 1 h, utilizando formalina tamponada a 10%. O fixativo é removido utilizando várias lavagens em PBS durante várias horas e, em seguida, bloqueado durante a noite utilizando 1% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS. Os anticorpos primários à proteína celular ou biomarcador de interesse são incubados com as construções durante 1 dia nas diluições listadas na tabela S2 numa solução de 0, 5 wt% BSA e 0, 125 WT% Triton X-100. A remoção de anticorpos primários não ligados é realizada utilizando um passo de lavagem contra uma solução de PBS ou 0, 5 wt% BSA e 0, 125 WT% Triton X-100 em PBS durante 1 dia. Os anticorpos secundários são incubados com as construções durante 1 dia nas diluições listadas na tabela S2 numa solução de 0, 5 wt% BSA e 0, 125 WT% Triton X-100 em PBS. As amostras são contra-manchadas com NucBlue ou ActinGreen durante 2 h E depois lavadas durante 1 dia em PBS antes da imagiologia.

imagem renderização e análise

microscopia de contrato de fase é realizada utilizando um âmbito de Leica DM IL invertida com objectivos que variam de 1,25 X A 40X. microscopia Confocal é realizada usando um Zeiss LSM 710 vertical com objectivos de imersão de água que variam de 5X a 40X empregando lasers espectrais em 405, 488, 514, 561 e 633 nm comprimentos de onda. As reconstruções de imagens de z-stacks são realizadas no ImageJ usando a função de z-projeção com a configuração de intensidade máxima de pixels. Quaisquer aumentos no brilho são realizados uniformemente em toda uma imagem z projetada. Reconstruções de imagens 3D e filmes rotativos (Movie S3) são realizados usando software Imaris. O novo Citosmart (Lonza) no sistema de incubação é usado para capturar imagens de lapso de tempo (Movie S2). A análise da imagem para quantificação da permeabilidade por difusão é realizada utilizando scripts personalizados de MATLAB utilizando métodos previamente relatados34. A análise da imagem TEM é realizada utilizando software ImageJ para medir a altura das células (n ≥ 50), a densidade de microvilli (n ≥ 25) e o comprimento de microvilli (n ≥ 150) em pelo menos 3 amostras independentes para cada condição.os dados da análise estatística são expressos em média ± desvio-padrão. A análise estatística é realizada utilizando MATLAB e a significância estatística é determinada com um valor de p < 0,05 conforme determinado por uma ANOVA utilizando o teste de comparação múltipla por pares de Tukey. Diferentes níveis de significância (valores p) são indicados com asteriscos e valores p específicos são fornecidos em cada legenda da figura.